SPF雞不同生長階段糞便菌群組成及多樣性研究

周 妍, 刁晨曦, 張圓圓, 于海波, 陸濤峰, 趙麗麗, 陳洪巖

(1. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室, 實驗動物與比較醫學創新團隊, 哈爾濱 150069; 2. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱 150030; 3. 牡丹江師范學院生命科學與技術學院, 牡丹江157011)

·禽類實驗動物的研究與應用·

SPF雞不同生長階段糞便菌群組成及多樣性研究

周 妍1,2, 刁晨曦1,3, 張圓圓1, 于海波1, 陸濤峰1, 趙麗麗1, 陳洪巖1

(1. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室, 實驗動物與比較醫學創新團隊, 哈爾濱 150069; 2. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱 150030; 3. 牡丹江師范學院生命科學與技術學院, 牡丹江157011)

目的 提供SPF雞不同生長階段腸道菌群的組成及多樣性數據。方法 采集10日齡、12周齡、23周齡和52周齡SPF雞糞便，利用Illumina HiSeq 2500高通量測序方法，對樣品16S rRNA的兩個高變區(V3-V4)進行測序分析，并進行了a-多樣性指數、b-多樣性指數和糞便群落特征分析。結果 四個生長階段糞便樣品菌群具有相似的較高的豐富度和良好的均勻度，物種多樣性無顯著差異(P>0.05); 厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度占95%以上; 乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌屬(Enterococcus)為優勢菌屬，不同時期豐度差異達顯著水平(P<0.05)。結論 四個生長階段菌群組成多樣，且優勢菌群主要為有益菌。該實驗結果能夠為SPF雞品質評定、健康監測和安全性評價提供依據。

SPF雞; 不同生長階段; 糞便菌群; 16s rRNA; Illumina HiSeq 2500高通量測序

SPF雞可以安全可靠地排除特定微生物及所攜帶病原體的干擾，其機體、胚及胚細胞可被用于腫瘤免疫學、藥物學、毒理學、血清和疫苗制造以及生物學鑒定等方面，因此在國內、外應用廣泛。SPF雞對非典型肺炎(SARS)疾病的控制和疫苗的研制起到了至關重要的作用。作為生物制品研發和疫病防控的前提和保障，SPF雞自身的健康狀況評定及其相應的基礎研究需要進一步明確。腸道微生物直接影響雞對飼料營養成分的分解、消化和吸收，對宿主的機能調節起到至關重要的作用[1]。基于SPF雞飼養環境及無動物性原料飼料影響其腸道發育及微生物區系情況的研究還未見系統報道。本研究利用Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺，針對中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家禽類種子中心SPF雞糞便菌群的組成及多樣性進行分析，以期獲得各生長階段的糞便菌群參數，為SPF雞的生長發育研究提供理論基礎，為雞群健康及生物安全監測提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與飼養管理

實驗用SPF雞來自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家禽類種子中心[SCXK(黑)2011-008], [SYXK(黑)2011-022], 選取10日齡(C組)、12周齡(B組)、23周齡(L組)和52周齡(P組)SPF雞各12只，公、母各6只，母雞相對應的時期為育雛期、育成期、產蛋前期和產蛋高峰期。隨機選3只飼養于一個正壓隔離器內，10日齡雛雞環境溫度25～27 ℃、其余時期溫度22～25 ℃; 相對濕度30%～70%; 壓力50～150 Pa; 12 h光照。上、下午定時定量飼喂，自由飲水。

1.2 飼料樣品的檢測

飼料根據不同生長階段由飼料生產廠家加工，經劑量25 kGy輻照滅菌，生產至使用期限不超過2 周。于采樣日期對輻照滅菌飼料的微生物進行檢測，大腸菌群(GB/T 18869-2002 飼料中大腸菌群的測定)、沙門氏菌(GB/T 13091-2002 飼料中沙門氏菌的檢測方法)、細菌(GB/T 13093-2006 飼料中細菌總數的測定)和霉菌(GB/T 13092-2006 飼料中霉菌總數測定方法)均未檢出。

參照GB/T 146991-2005 飼料采樣要求，采集每個生長階段輻照后無菌飼料樣品3個; 各生長階段飼料主要營養成分測定方法及計算方法參照國標: 水分(GB/T 6435-2014 飼料中水分的測定)、粗蛋白(GB/T6432-1994飼料中粗蛋白的測定方法)、粗灰分(GB/T 6438-2007飼料中粗灰分的測定)、粗脂肪(GB/T 6433-2006飼料粗脂肪測定方法)、粗纖維(GB/T 6434-2006飼料中粗纖維測定方法), 鈣(GB/T 6436-2002 飼料中鈣的測定)、總磷(GB/T 6437-2002飼料中總磷的測定分光光度法)，飼料主要營養成分見表1。

1.3 糞便樣品的收集與處理

分別于10日齡、12周齡、23周齡和52周齡當日，早晨喂食前, 無菌取新鮮糞便(盡量多取), 將同一隔離器內3只雞糞便均勻混合為一個樣品，每個時間點最終為4份樣品，取2 g糞便放入無菌的2 mL離心管中, 液氮速凍, -80 ℃冰箱保存備用。

表1 各生長階段飼料主要營養成分Table 1 The main nutrient content at each stage of growth %

1.4 糞便樣品分析

1.4.1 糞便DNA提取 糞便樣品中的細菌基因組DNA采用目前在腸道微生態研究中廣泛應用的商品化糞便 DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit, 貨號: 51504)提取。對于所提取樣本DNA, 采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher, 美國)測定其濃度,將合格樣品(A260/280=1.8～2.0, 濃度≥50 ng/mL, 總量≥2 mg)送至諾禾致源公司(北京)進行高通量測序。

1.4.2 PCR擴增及擴增產物的純化 取適量樣品于離心管中, 使用無菌水稀釋樣品至1 ng/mL。以稀釋后的基因組DNA為模板, 根據測序區域的選擇, 使用帶 Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的 PhusionòHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶擴增16s rRNA V3-V4區。根據PCR產物濃度進行等量混合樣品，充分混勻后使用質量分數2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，利用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的條帶。

1.4.3 文庫構建和上機測序 使用TruSeqòDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq 2500 PE250(諾禾致源公司，北京)進行上機測序。

1.4.4 測序數據的處理 根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列得到的拼接序列為原始Tags數據(Raw Tags), 經過拼接和質控得到高質量的Tags數據(Clean Tags), 再進行Tags截取、Tags長度過濾和去除嵌合體序列, 得到最終的有效數據(Effective Tags)。基于有效數據進行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類。

1.5 數據統計分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。對OTUs代表序列進行物種注釋和分析，獲得分類學信息。并分別在各個分類水平：界、門、綱、目、科、屬、種統計各樣本的群落組成形成分類樹。根據物種注釋結果，選取每個樣品在門和屬上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。進一步對 OTUs進行豐度分析、a-多樣性和b-多樣性計算等，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息等。

a-多樣性用于分析樣本內的微生物群落多樣性[2], 通過單樣本的多樣性分析可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算稀釋曲線和Rank Abundance曲線。

b-多樣性是對不同樣本的微生物群落構成進行比較分析。首先根據所有樣本的物種注釋結果、OTUs之間的系統發生關系及各樣本中微生物序列間的進化信息, 計算Unifrac距離(Unweighted Unifrac)[3],結合OTUs的豐度信息進一步構建Weighted Unifrac距離[4]通過無度量多維標定法(NMDS, Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)從中發現不同樣品(組)間的差異。為進一步挖掘分組樣品間的群落結構差異，選用t檢驗統計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結果進行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高通量測序數據

四個生長階段即10日齡(C組)、12周齡(B組)、23周齡(L組)和52周齡(P組)共16個糞便樣品(C.1、 C.2、C.3、C.4、B.1、B.2、B.3、B.4、L.1、L.2、L.3、L.4、P.1、P.2、P.3、P.4)經過Illumina Hi Seq 2500平臺測序后分別得到各自的下機數據Raw PE(原始的PE Reads)，經過拼接和質控后得到Clean Tags(高質量的Tags數據)，經過嵌合體過濾后得到Effective Tags (有效數據)。16個樣品高通量測序后共得到560 822條可用于分析的序列。以97%的一致性, 將每個樣品所得的序列聚類成OTU,四個時期的平均OTU數為908、747、721和958 (表2)。

根據物種注釋情況，統計每個樣品注釋到各分類水平上的序列數目，在界(Kingdom)、門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)、種(Species)7個水平上, 10日齡序列數分別為33 074、33 059、33 028、32 921、32 522、28 574、和11 979; 12周齡30 860、30 853、30 841、30 760、30 567、28 479和8 345; 23周齡35 402、35 392、35 367、35 257、35 004、33 103和11 040; 52周齡34 126、34 111、34 083、33 971、33 611、30 494和7 033。

根據四個分組的物種分類結果，篩選特別關注的物種(默認選擇最大相對豐度前10的屬)進行物種分類樹統計，分組的物種分類樹見圖1。如圖所示，總體展現了組間菌的種類在各個分類水平上的分布及所占比例。厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)占所有物種的百分率為63.62%、4.83%和4.78%。乳酸菌屬(Lactobacillus)、Romboutsia、大腸志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、Alistipes、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌(Enterococcus)、Lachnoclostridium、Blautia和Faecalibacterium占所有物種的百分率為47.10%、4.96%、4.82%、3.27%、2.18%、1.51%、2.51%、3.52%、1.81%和1.55%。

表2 各生長階段糞便樣品的Tags 和 OTUs 數目統計表Table 2 Tags and OTUs number of stool samples at each growth stage

2.2 各時期SPF雞糞便群落特征

2.2.1 物種相對豐度展示 選取門(圖2)和屬(圖3)水平最大豐度排名前10的物種生成的物種相對豐度柱形圖。從圖2中可知, 排名前十的菌群為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(V er ru c om ic r ob ia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。B組和L組的厚壁菌門(Firmicutes)豐度分別顯著高于C組(P=0.022; P=0.024)和P組(P=0.034; P=0.042); P組擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著高于B(P=0.044)組和L組(P=0.046); C組和P組的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)豐度顯著高于B組(P=0.025; P=0.041)。其余門的豐度各組間差異未達到顯著水平(P>0.05)。

圖1 分組物種分類樹Figure 1 Classification tree of each group

圖2 樣品在門水平物種相對豐度Figure 2 Relative abundance of species in phylum level

圖3 樣品在屬水平物種相對豐度Figure 3 Relative abundance of species in genus level

從圖3中可知，排名前十的菌群為乳桿菌屬(Lactobacillus)、Romboutsia、大腸志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、Alistipes、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌(Enterococcus)、Lachnoclostridium、Blautia、Faecalibacterium。B組乳酸菌屬(Lactobacillus)豐度顯著高于P組(P=0.022)和C組(P=0.021); L組鏈球菌屬(Streptococcus)豐度顯著高于C組(P=0.016)、B組(P=0.016)和P組(P=0.017); P組擬桿菌屬(Bacteroides)豐度顯著高于C組(P=0.033)和B組(P=0.032); B組腸球菌(Enterococcus)顯著高于C組(P=0.029)。其余屬的豐度各組間差異未達到顯著水平(P>0.05)。

2.2.2 各時期SPF雞糞便群落的a-多樣性 稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。全部樣本的稀釋曲線如圖4所示，每組樣品的稀釋曲線均趨于平緩或接近平臺期，說明測序數據量漸進合理。

圖4 稀釋曲線Figure 4 Rarefaction curves of samples

圖5 等級豐度曲線Figure 5 Rank Abundance distribution

等級豐度(Rank Abundance)曲線可直觀的反映樣品中物種的豐富度和均勻度，在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大; 在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣品中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻。本實驗樣本的等級豐度曲線如圖5所示。4組樣本曲線走勢相似，各組糞便樣本具有相似的豐度和均勻度。2.2.3 細菌群落結構的相似性分析 b-多樣性研究中，選用加權Unifrac距離(Weighted Unifrac)和不加權Unifrac距離(Unweighted Unifrac)兩個指標來衡量兩個組間的相異系數，其值越小，表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。以Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離繪制的Heatmap展示結果見圖6，以Weighted Unifrac差異排序為BL

非度量多維標定法(NMDS)是非線性模型, 其設計目的是為了克服線性模型(包括PCA、PCoA)的缺點，更好地反映生態學數據的非線性結構。應用NMDS分析，根據樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現，能夠反映樣本的組間和組內差異等。基于OTU水平的NMDS分析結果展示見圖7。不同時期分組組大致可以分開，部分組別聚集程度較好，如C組和P組，但部分組仍存在交疊現象; 部分樣品組內聚集程度不好，需進一步加大樣本進行分析。

圖6 b-多樣性指數熱圖Figure 6 Heat maps of beta diversity

圖7 NMDS分析Figure 7 NMDS analysis

3 討論

SPF雞通常不存在對實驗研究可能產生干擾的微生物，而且雞對各種病原敏感，且反應一致，重復性好。因此，為禽病致病機理研究、免疫機理研究、流行毒株的致病性研究、疫苗的制備和鑒定、檢測試劑制備、禽病治療用制品等工作提供基礎[5]。SPF雞除了不攜帶國家標準規定的19種病原以外，還應維持種群及健康的穩定。目前，腸道被認為是機體最重要的防御器官，在吸收營養物質的同時，阻止腸腔內細菌及其內容物對機體的侵襲，為機體內環境的穩定及健康提供保障。最新研究表明，腸道微生物對機體的影響，不僅局限于腸道本身，其種類以及多樣性直接調節宿主的免疫功能、代謝功能及神經調節[6]。與正常雞群相比，SPF雞特殊的無菌飼養環境及滅菌的無動物性原料飼料配方，都對其腸道發育和菌群產生影響。

SPF雞胚孵化出殼后，即飼養于無菌正壓隔離器中，盡管環境、水與飼料無菌，但在10日齡雛雞的糞便中，仍舊檢測到大量的多樣的菌群，其OTU數與52周齡雞接近, 且高于12周齡和23周齡。雛雞出殼前其消化道是無菌的，出殼后約1 h,就可在嗉囊、腺胃中檢出細菌[7]，隨后出現細菌的大量繁殖，在生長過程中，經胃腸道內厭氧環境和飼料刺激，從而達到本研究檢測到的水平，其他菌群一并隨著年齡的增長而變化。

本研究表明, 10日齡時, 在腸道菌群中, 厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)占優勢比例, 這與之前報道[8]的很多哺乳動物及一般飼養環境雞的菌群的狀況一致。本研究中變形菌門(Proteobacteria)的豐度比例10日齡高于12周齡、23周齡和52周齡, 但差異未達到顯著水平。研究表明, 厚壁菌門/擬桿菌門的比例, 與肥胖相關[9], 體制含量高的人比例高, 而52周齡時厚壁菌門/擬桿菌門的比例顯著低于12和23周齡, 推斷脂肪被動員用作母雞的產蛋或公雞的性機能維持。85日齡散養大骨公雞盲腸菌群中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)豐度是籠養的3.25倍[10], 雞的糞肥中同樣檢測到芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的存在[11]。本研究結果表明高齡和低齡SPF雞糞便中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)顯著高于12周齡。

李猶平[12]利用 ERIC-PCR指紋圖譜技術研究雞腸道微生物群落結構的變化，其結果顯示雞腸道菌群主要由乳酸桿菌、擬桿菌、大腸桿菌及腸球菌四類細菌組成。與此結論相類似，本研究不同時期差異顯著的菌群為乳酸桿菌、擬桿菌及腸球菌。生理有益菌[1]乳桿菌屬(Lactobacillus)，可以發酵碳水化合物產生乳酸，阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，維持腸道的微生態平衡，保護腸道黏膜屏障，增強機體免疫力，促進消化等[13]。在屬水平上，各周齡占比分別為10日齡35.27%、12周齡61.58%、23周齡53.47%和52周齡38.04%，乳桿菌屬(Lactobacillus)是絕對優勢菌群，且12周齡時豐度顯著高于10日齡和52周齡。1日齡嶺南黃肉雞基礎日糧+50 mg/kg硫酸新霉素(干品效價為675 U/mg)飼養42日后，回腸粘膜乳桿菌屬(Lactobacillus)較未添加硫酸新霉素組顯著增加, 達到49.46%成為優勢菌群[14]。與之相比, SPF雞無需添加藥物, 腸道有益菌占比已達最大。靳利娥等[15]利用酸性培養基對篩選出雞嗉囊內的內源益生菌為細菌的鏈球菌屬(Streptococcus)、乳酸的桿菌屬、真菌的酵母菌。本研究顯示23周齡的鏈球菌屬(Streptococcus)占6.61%, 顯著高于其他時間點(10日齡0.76%、12周齡0.62%和52周齡0.73%)。1日齡羅曼粉殼蛋雞基礎日糧分別添加1×107CFU/g枯草芽孢桿菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌飼養32周，盲腸內容物擬桿菌屬(Bacteroides)為優勢菌群,本研究中SPF雞糞便菌群擬桿菌屬(Bacteroides)為10大優勢菌群之一, 其與自然飼養環境下雞添加益生菌的效果和比例近似。腸球菌屬(Enterococcus)目前被認為是腸道有益菌之一, 具有抑制大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌的生長，起到調整腸道菌群失調的作用[16]。本研究中腸球菌屬豐度在12周齡時(3.82%)顯著高于10日齡(1.07%), 在無有害菌威脅的情況下，有益菌占據腸道并大量增值, 23周齡(2.88%)和52周齡(2.28%)時同樣維持較高水平。本實驗中對于SPF雞性別引起的糞便菌群差異未作進一步研究，可作為下一步的研究內容。

本研究利用HiSeq測序技術對中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家禽類種子中心飼養的健康SPF雞不同時期腸道菌群變化進行分析，揭示了糞便菌群的豐度和多樣性, 為SPF雞的腸道健康及品質評定提供參考, 為雞群的生物安全監測提供依據。

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Composition and Diversity of Fecal Microflora in SPF Chickens at Different Growth Stages

ZHOU Yan1,2, DIAO Chen-xi1,3, ZHANG Yuan-yuan1, YU Hai-bo1, LU Tao-feng1, ZHAO Li-li1, CHEN Hong-yan1
(1. Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China;
2. College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;
3. College of Life Science and Technology, Mudanjiang Normal University, Mu Danjiang 157011, China)

ObjectiveTo provide the composition and diversity of intestinal flora at different growth stages of SPF chickens .MethodsThe feces of SPF chickens at 10 d , 12 weeks , 23 weeks and 52 weeks old were collected. The two hypervariable regions (V3-V4) of the 16S rRNA of the samples were sequenced using the Illumina HiSeq 2500 platform, and the alpha diversity, beta diversity and fecal community characteristics were analyzed .ResultsThe fecal flora sample at four time points had similar high abundance and good uniformity and there was no significant difference in species diversity between the two groups (P>0.05). More than 95% of abundance were found in Firmicutes, Proteobacteria and Bacteroidetes; Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, and Enterococcus were dominant species, and the abundance of different periods were significantly different (P<0.05) .ConclusionsThe feces flora of SPF chiken at different growth stages are diverse, and the dominant bacteria are mainly beneficial bacteria. The experimental results are expected to provide the basis for assessing the quality, health monitoring and safety evaluation of SPF chickens.

SPF chicken; Different growth stages; Feces microbiota; 16s rRNA; Illumina HiSeq 2500 platform

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0231-09

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.013

2017-03-16

國家科技支撐計劃(2015BAI07B02-02); 中國農業科學院基本科研業務費專項(Y2016PT41); 國家自然科學基金(31601974)

周 妍(1993-), 女, 碩士。研究方向: 實驗動物與比較醫學。E-mail: 2609814396@qq.com共同第一作者: 刁晨曦(1992-), 女, 碩士。研究方向: 實驗動物與比較醫學。E-mail: 2410880274@qq.com

陳洪巖(1963-), 男, 研究員。研究方向: 實驗動物與比較醫學。E-mail: hychen @hvri.ac.cn