鵝細小病毒VP3蛋白抗血清的制備及在鴨胚和鴨胚成纖維細胞中的增殖研究

牛銀杰, 劉柏含, 趙麗麗, 孫 暢, 陳洪巖

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室, 實驗動物與比較醫學創新團隊, 哈爾濱 150069)

鵝細小病毒VP3蛋白抗血清的制備及在鴨胚和鴨胚成纖維細胞中的增殖研究

牛銀杰, 劉柏含, 趙麗麗, 孫 暢, 陳洪巖

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室/黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室, 實驗動物與比較醫學創新團隊, 哈爾濱 150069)

目的 制備鵝細小病毒(GPV) VP3衣殼蛋白的兔抗血清, 在紹興麻鴨鴨胚及其成纖維細胞中成功增殖GPV。方法 根據GPV H 分離株的VP3基因序列構建原核表達載體pET3a -VP3，誘導純化VP3蛋白, 皮下注射免疫新西蘭白兔, 收集和純化VP3抗血清, 經Western blotting檢測VP3抗血清與VP3蛋白的反應性。GPV H株鵝胚尿囊液接種SPF紹興麻鴨胚和其成纖維細胞, 通過PCR反應和間接免疫熒光方法, 檢測GPV在鴨胚及其成纖維細胞中的增殖。結果 成功制備了VP3的兔抗血清，同時GPV在鴨胚及其成纖維細胞中進行良好增殖。 結論 VP3抗血清的制備及GPV在紹興麻鴨鴨胚及成纖維細胞中的增殖實驗為GPV分子生物學特性及致病機制的研究奠定基礎。

鵝細小病毒(GPV); VP3基因; VP3抗血清; 增殖

小鵝瘟(Gosling plaque)，是由鵝細小病毒(goose parvovirus, GPV)引起的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病, 該病具有病程短、傳染性強、傳播快、死亡率高等特點[1]。GPV屬于細小病毒科，細小病毒屬，病毒粒子為六角形或球形,無囊膜，其基因組為單鏈、線性DNA，大小約5.2 kb，由兩個開放讀碼框組成，右側讀碼框編碼衣殼蛋白VP1，VP2和VP3，左側編碼非結構蛋白NS1和NS2[2]。其中VP3衣殼蛋白是GPV的主要衣殼蛋白, 約占衣殼蛋白總量的80%, 是主要免疫保護型抗原蛋白[3-5]。目前，GPV的夾心ELISA 方法還未建立，因此VP3抗血清的制備是十分必要。

GPV對體外培養物的專一性很強，初代分離培養GPV時，只能用鵝胚、番鴨胚及鴨胚成纖維細胞(DEFs)，其他細胞和禽胚均不能使其增殖。GPV 經鵝胚連續培養十幾個代次后，在DEFs中培養，不能形成病變, 培養物中病毒的滴度也很低。病毒分離及繁殖的局限阻礙了GPV致病機制及其生物學特性的研究。

本實驗在麻鴨胚及其DEFs培養增殖GPV, 利用原核表達系統表達VP3蛋白, 制備VP3兔抗血清, 為GPV診斷方法的建立及其致病機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和實驗動物

質粒pET30a由本實驗室保存，DEFs由本實驗室制備; 紹興麻鴨鴨胚取自哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心[SCXK(黑)2011-008], [SYXK(黑)2011-022];感受態細胞BL21(DE3)和DNA marker購自TaKaRa公司。SPF 新西蘭白兔購自長春生物制品有限公司[SCXK(吉)-2013-0002]。

1.2 主要試劑和培養基

T4 DNA 連接酶和限制性內切酶購自美國NEB公司。質粒提取試劑盒和PCR產物純化試劑盒購自全式金公司，DNA提取試劑盒購自美國Omega公司。弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自德國Sigma公司。異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自索萊寶。兔源紅外標記抗體購自LI-COR公司。

1.3 病毒的增殖

200 mL GPV 尿囊液接種8個11日齡紹興麻鴨,記錄鴨胚的死亡情況, 并觀察胚體的變化。同時在DEFs上接種GPV, 觀察細胞的病變情況。收取尿囊液和細胞上清, 提取病毒DNA, 進行PCR鑒定。

1.4 載體的構建和鑒定

根據H 株VP3基因序列設計上下游引物，上游: CGGGATCCA TGGCAGAGGGAGG AGGCGGAGCTT(下劃線為酶切位點); 下游: CCAAGCTTTTACAGATTTTGAGTTAGATATCTG(下劃線為酶切位點)擴增VP3基因。將擴建成功的VP3與載體pET30a進行雙酶切, 凝膠回收后, 使用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。將連接產物轉化感受態BL(DE3)，挑取菌落PCR鑒定陽性菌，經測序鑒定成功的重組質粒命名為pET 30a-VP3。

1.5 重組蛋白誘導純化

將活化后的重組菌液1∶100轉接至100 mL含100 mg/L Kana的LB培養基中37℃培養至A600=0.4～ 0.6, 1∶100加入誘導劑IPTG，37℃繼續培養4 h。將培養的菌液進行蛋白純化。

1.6 抗血清的制備

將純化好的蛋白與等體積的弗氏佐劑充分乳化后, 每只兔1 mg的用量進行背部皮下多點注射。初次免疫使用完全佐劑，二次和三次免疫使用不完全佐劑, 其時間間隔為2周。經兔耳緣靜脈采血, 采用間接ELISA測定兔血清效價。三次免疫后間隔1周加強免疫, 心臟采血, 分離血清, 分裝后保存備用。

1.7 Western blotting鑒定抗血清的反應原性

分別收集小量誘導表達純化的蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，用半干法將蛋白轉到硝酸纖維素膜(NC膜)上，進行封閉2 h，洗膜3次每次5 min后，加入1∶200稀釋的兔抗血清室溫孵育2 h, PBST 漂洗一抗后加入1∶8 000稀釋兔源紅外標記抗體，室溫溫育1 h，洗膜3次后，紅外掃描保存結果。

1.8 間接免疫熒光檢測

制作原代DEFs細胞，消化細胞均勻鋪在6孔板中，細胞長至80%～90%，接種100個50%組織細胞感染量(TCID50) GPV, 37 ℃體積分數5% CO2溫箱中培養48 h后，VP3抗血清為一抗，異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔IgG為二抗，利用倒置熒光顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 病毒的增殖情況

GPV接種鴨胚4 d后, 無鴨胚死亡, 觀察胚體無明顯病變, 與對照一致。而DEFs在120 h出現病變。提取尿囊液核酸, PCR鑒定在1 605 bp位置出現條帶(圖1), 證明GPV在鴨胚中進行了良好的增殖。

圖1 GPV增殖的PCR鑒定Figure 1 Identification of GPV replication by PCR

2.2 原核載體pET30a-VP3的鑒定及VP3蛋白表達

pET30a-VP3測序結果正確。誘導表達蛋白經過純化大小與預期VP3蛋白大小一致，約為70 000,證明成功表達VP3蛋白(圖2)。

圖2 重組VP3蛋白的SDS-PAGED的鑒定Figure 2 Identification of recombinant VP3 protein by SDS-PAGE

2.3 Western blotting鑒定多克隆抗體的特異性檢測

Western blotting結果表明兔多抗具有特異性和良好的反應原性(圖3)。

2.4 間接免疫熒光

VP3抗血清與接種GPV的DEFs反應良好，與沒有接毒的細胞無反應(圖4)。進一步說明GPV在DEFs中具有良好的增殖。

圖3 VP3的Western blotting鑒定Figure 3 VP3 identification of Western blotting

3 討論

GPV的自然宿主是鵝和番鴨，所有品系的家鵝均易感，除番鴨和莫斯科鴨外，其他動物均無易感性[6]。GPV在進行初次分離時，只能用鵝胚和番鴨胚或是它們的原代成纖維細胞才能使它們增殖進行分離。在本研究中，利用紹興麻鴨及其

圖4 VP3的間接免疫熒光鑒定Figure 4 VP3 identification of Indirect immunofluorescence

DEFs增殖GPV，結果表明，GPV能在麻鴨胚及其DEFs進行良好的增殖。GPV在麻鴨胚及其DEFs的增殖為GPV致病機制的研究奠定了基礎。

GPV的基因編碼衣殼蛋白VP1, VP2和VP3，他們有共同的羧基端。其中VP3是主要結構蛋白，約占總蛋白的80%[7]。VP3蛋白氨基酸序列大多位于病毒粒子的表面, 含有GPV的主要抗原決定簇, 可以誘導產生中和抗體[8]。為了構建夾心ELISA方法,作者構建了原核表達載體pET30a-VP3, 誘導表達了VP3蛋白, 免疫新西蘭白兔, 制備了VP3兔抗血清。VP3蛋白和VP3抗血清的成功制備, 為VP3蛋白單抗的制備及其診斷方法的建立提供了便利條件。

[1] 吳清民. 獸醫傳染病學[M]. 北京: 中國農業大學出版社, 2002:312-315.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學[M]. 第2版. 北京: 科學出版社, 1997:1165-1167.

[3] Le Gall-Recule G, Jestin V, Chagiaud P. Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP32 and VP33) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins[J]. J Gen Virol, 1996, 77(9):2159-2163.

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[5] 許洪潔, 張鑫, 夏銘琦, 等.小鵝瘟病毒VP3基因真核表達質粒在小鼠中的免疫效果[J]. 中國獸藥雜志, 2008, 42(1):5-8.

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Preparation of Goose Parvovirus VP3 Antiserum and Identification of Propagation in Duck Embryo and Duck Embryo Fibroblasts

NIU Yin-jie, LIU Bai-han, ZHAO Li-li, SUN Chang, CHEN Hong-yan
(Division of Laboratory Animal and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comparative Medicine, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China)

ObjectiveTo prepare antiserum against VP3 protein and propagate goose parvovirus (GPV) H in duck embryo and duck embryo fibroblasts (DEFs) .MethodsThe prokaryotic expression vector pET30a-VP3 were constructed based on VP3 seqeucne of GPV H. VP3 protein was induced, expressd and purified, then immunized the New Zealand white rabbit. The VP3 antiserum was collected, purified and verified by Western blotting. GPV H fluid was inoculated into shaoxing duck embryo and DEFs, and the propagation of GPV was identified by PCR and indirect immunofuorescence. Result The VP3 antiserum was successfully prepared, and GPV H was well propagated in shaoxing duck embryo and DEFs .ConclusionVP3 antiserum preparation and GPV replication in duck embryo and DEFs may be provided basis for GPV molecular biological characteristic and pathogenic mechanism research.

Goose parvovirus (GPV); VP3 gene; VP3 antiserum; Propagation

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0240-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.014

2017-04-06

國家科技支撐計劃(2015BAI07B02-02); 中國農業科學院基本科研業務費專項(Y2016PT41); 黑龍江省自然科學基金重點項目(ZD2016006)

牛銀杰(1987-), 女, 博士研究生, 研究方向: 預防獸醫學。E-mail: niuyinjie0530@163.com;

共同第一作者: 劉柏含(1992-), 女, 碩士研究生,研究方向: 微生物學。E-mail: liubaihan456@163.com

陳洪巖(1963-), 男, 博士, 研究員, 研究方向: 實驗動物與比較醫學。E-mail: chenhongyan@caas.cn