MicroRNA在山楂酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用研究

白 雪，李 慧，張 月，彭 揚(yáng)，何 平

MicroRNA在山楂酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用研究

白 雪，李 慧，張 月，彭 揚(yáng)，何 平*

目的 探討MicroRNA在山楂酸誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)作用。方法 將人的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549經(jīng)過(guò)山楂酸干預(yù)，并提取處理后A549細(xì)胞的總RNA,通過(guò)AFFX miRNA表達(dá)譜芯片，檢測(cè)山楂酸作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異情況。通過(guò)生物信息學(xué)，分析預(yù)測(cè)miRNA作用的靶蛋白。結(jié)果 山楂酸作用前后肺癌細(xì)胞A549中59個(gè)miRNA表達(dá)差異顯著，其中23個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào)，36個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，由miRNA調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白400余個(gè)，細(xì)胞凋亡相關(guān)靶蛋白300余個(gè)，其中XIAP是miR-630下游調(diào)控的靶蛋白。結(jié)論 山楂酸可能通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。

肺癌；MicroRNA；山楂酸

0 引言

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，具有高度的物種保守性[1]。目前，有1 000多種miRNA已被命名，盡管在人類基因組中所占比例極小，但miRNA調(diào)控著人體內(nèi)超過(guò)1/3的基因表達(dá)[2]。miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)時(shí)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其主要的調(diào)控方式是通過(guò)與目標(biāo)mRNA結(jié)合進(jìn)而抑制其翻譯或使其降解，達(dá)到干擾靶mRNA翻譯，從而調(diào)控靶mRNA基因的表達(dá)，在細(xì)胞周期的各個(gè)階段，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡中起重要作用[3-5]。

中草藥單體多從天然植物中提取，與西藥化療藥物相比毒副作用小，已成為近年來(lái)抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[6-9]。山楂酸是從油橄欖、紅棗、山楂等植物中提取出來(lái)的天然有機(jī)化合物單體，已有研究表明,山楂酸對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[10]。目前,對(duì)于中藥抗腫瘤的機(jī)制，主要是關(guān)于編碼蛋白表達(dá)調(diào)控的研究，而非編碼miRNA表達(dá)調(diào)控的研究較少。近年來(lái)已有研究顯示，在中藥抗腫瘤的過(guò)程中，miRNA可能作為癌基因或抑癌基因參與其中。中藥作用后，作為抑癌基因的miRNA表達(dá)增加，可通過(guò)促進(jìn)其靶基因(原癌基因)降解或抑制靶基因(原癌基因)的翻譯來(lái)下調(diào)原癌基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)中藥抗腫瘤的作用；同樣，作為癌基因的miRNA表達(dá)減少，亦可通過(guò)對(duì)其靶基因(抑癌基因)翻譯后水平的負(fù)調(diào)控作用來(lái)上調(diào)抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的目的[11]。這些為深入研究中藥抗腫瘤機(jī)制開辟了新的方向。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)AFFX miRNA表達(dá)譜芯片篩選山楂酸作用于A549細(xì)胞前后miRNA的表達(dá)變化。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，篩選出miRNA所調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白及細(xì)胞凋亡相關(guān)靶蛋白，在miRNA水平研究山楂酸抑制A549細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于天津索萊寶生物工程有限公司，胰蛋白酶購(gòu)于以色列Biological Industries公司，Trizol購(gòu)于大連寶生物工程公司，離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD型)購(gòu)于蚌埠凈化設(shè)備廠，倒置顯微鏡(Olympus CKX31)購(gòu)于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為0.5-1×106/mL。接種細(xì)胞后培養(yǎng)過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，開始進(jìn)行藥物干預(yù)。

1.2.2 miRNA表達(dá)差異檢測(cè)方法 AFFX miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)山楂酸作用前后A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)差異。①細(xì)胞處理：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜，并加入終濃度為18 μg/mL的山楂酸溶液，采用等量RPMI-1640的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，置于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②細(xì)胞總RNA提取：樣品經(jīng)過(guò)PBS緩沖液漂洗后，加入1 mL Trizol溶液，室溫靜置5 min。加200 μL氯仿于混合液中，將混合液進(jìn)行離心，加入異丙醇(體積比為1∶1)，充分混勻后離心(4 ℃，12 000 r/min，30 s)，棄上清，獲取總RNA。③樣本RNA處理:取1 μg樣本總RNA，加入500 μL 1 mmol Tris Cl，1 μL ATP mix充分混勻并置于冰上。添加2 μL RNA Spike Control Oligos，5 μL Poly(A) Tailing Mix，輕彈管壁數(shù)次使其充分混勻，快速離心(5 s)收集溶液于管底，37 ℃溫育15 min。④生物素標(biāo)記MicroRNA:添加4 μL 5X FlashTag Ligation Mix Biotin，2 μL T4 DNA Ligase于上述體系，并于25 ℃溫育30 min。添加2.5 μL Stop Solution終止反應(yīng)，瞬時(shí)離心(5 s)，收集溶液于管底，置于冰上。⑤芯片雜交和掃描:取出芯片并使芯片溫度平衡至室溫，將雜交液加入到標(biāo)記好的miRNA體系中瞬時(shí)離心(5 s),收集溶液于管底，99 ℃溫育5 min，45 ℃溫育5 min。混合液于離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心5 min，除去雜交混合液中的不溶性物質(zhì)。芯片中注入100 μL雜交液并放置于雜交爐中，48 ℃、60 r/min旋轉(zhuǎn)雜交16 h。雜交結(jié)束后吸棄雜交液，加入100 μL Array Holding Buffer，將芯片進(jìn)行清洗染色，最后進(jìn)行掃描。

1.3 結(jié)果分析 對(duì)miRNA的差異表達(dá)進(jìn)行篩選：在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果顯示變化方向和程度一致。靶基因預(yù)測(cè)：使用3種預(yù)測(cè)方法分析miRNA的靶基因。具體預(yù)測(cè)算法為：targetScan，picTar，miRanda。將所有的靶基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能注釋分析，然后將分別與細(xì)胞增殖和凋亡的基因篩選出來(lái)，整理成列表形式。

2 結(jié)果

2.1 山楂酸作用于A549細(xì)胞前后miRNA的表達(dá)變化 AFFX miRNA表達(dá)譜芯片篩選山楂酸作用于A549細(xì)胞前后miRNA的表達(dá)變化,軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),59個(gè)miRNA表達(dá)差異顯著(10倍以上改變)，其中23個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào)，36個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)。見表1。

表1 部分篩查表達(dá)差異的miRNA

2.2 miRNA靶基因預(yù)測(cè) 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,由上述miRNA調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白400余個(gè)，細(xì)胞凋亡相關(guān)靶蛋白300余個(gè)，其中XIAP是miR-630下游調(diào)控的靶蛋白(見表2)。

3 討論

miRNA最早是由Lee在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，后期科學(xué)家們證實(shí)，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)亦廣泛存在，通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)參與了多種生物功能的調(diào)節(jié)。其主要作用方式是在翻譯后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，具體機(jī)制為通過(guò)與靶mRNA 的3′UT互補(bǔ)配對(duì)，從而促進(jìn)靶mRNA 的降解或抑制其翻譯[12-13]。研究表明，miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，具有癌基因或抑癌基因雙重作用[14-15]。增強(qiáng)或抑制抑癌基因性或癌基因性miRNA的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。目前已經(jīng)有超過(guò)40種miRNA被證實(shí)與肺癌有關(guān)，如Let-7、miR-13、miR-34、miR-145及miR-126等[16-19]，它們通過(guò)在肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯，發(fā)揮其癌基因或抑癌基因作用，影響肺癌的發(fā)展進(jìn)程。

miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡中起重要的調(diào)控作用。miRNA及其調(diào)控對(duì)象，都可能成為藥物作用靶點(diǎn)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物能改變腫瘤細(xì)胞miRNA的表達(dá)，其表達(dá)的變化可能與藥物抗腫瘤作用相關(guān)[20-21]。miRNA可能作為抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的策略和思路。目前在miRNA分子水平研究中藥治療腫瘤作用機(jī)制的報(bào)道較少，有待于進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AFFX miRNA表達(dá)譜芯片篩選山楂酸作用于A549細(xì)胞前后miRNA的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)包括miR-630在內(nèi)的59個(gè)miRNAs表達(dá)有顯著差異(差異改變均大于10倍)，其中23個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，36個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，由上述miRNA調(diào)控的細(xì)胞增殖相關(guān)靶蛋白400余個(gè)，細(xì)胞凋亡相關(guān)靶蛋白300余個(gè)，其中XIAP是miR-630下游調(diào)控的靶蛋白。有研究表明，miR-630參與調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞死亡，順鉑作用后伴隨miR-630表達(dá)升高[23]。通過(guò)上述文獻(xiàn)結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析，我們初步判定miR-630表達(dá)上調(diào)可能參與了調(diào)控山楂酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楂酸可能通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用。本研究初步探討了miRNA在山楂酸抑制肺腺癌系A(chǔ)549細(xì)胞中的作用，為中藥抗腫瘤的機(jī)制研究提供了新的方向和理論依據(jù)，為進(jìn)一步在山楂酸抑制肺癌A549細(xì)胞miRNA調(diào)控水平的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

表2 部分miRNA靶基因預(yù)測(cè)

[1] Jevsinek SD,Godnic I,Zorc M,et al.Genome-wide in silico screening for microRNA genetic variability in livestock species[J].Anim Genet,2013,44(6): 669-677.

[2] Koufaris C.Human and primate-specific microRNAs in cancer:evolution,and significance in comparison with more distantly-related research models:the great potential of evolutionary young microRNA in cancer research[J].Bioessays,2016,38(3):286-294.

[3] Zhang R,Li F,Wang W,et al.The effect of antisense inhibitor of miRNA 106b approximately 25 on the proliferation,invasion,migration,and apoptosis of gastric cancer cell[J].Tumour Biol,2016，37(8):10507-10515.

[4] Fan SJ,Li HB,Cui G,et al.miRNA-149* promotes cell proliferation and suppresses apoptosis by mediating JunB in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2016,41:62-70.

[5] Lu K,Wang J,Song Y,et al.miRNA-24-3p promotes cell proliferation and inhibits apoptosis in human breast cancer by targeting p27Kip1[J].Oncol Rep,2015,34(2): 995-1002.

[6] Xu J,Song Z,Guo Q,et al.Synergistic effect and molecular mechanisms of traditional Chinese medicine on regulating tumor microenvironment and cancer cells[J].Biomed Res Int,2016,2016:1490738.

[7] Guo Q,Li J, Lin H.Effect and molecular mechanisms of traditional Chinese medicine on regulating tumor lmmunosuppressive microenvironment[J].Biomed Res Int,2015,2015:261620.

[8] Wang YJ,Li Q,Li YJ,et al.Current status of traditional Chinese medicine on reversing tumor multi-drug resistance[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2014,39(24): 4693-4698.

[9] Liu M, Jia LQ.Preliminary clinical experience of Prof.Li Pei-wen in treating complications of tumor by external treatment of traditional Chinese medicine[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2014,34(11):1390-1391.

[10]Li C,Yang Z,Zhai C,et al.Maslinic acid potentiates the anti-tumor activity of tumor necrosis factor alpha by inhibiting NF-kappaB signaling pathway[J].Mol Cancer,2010，9:73.

[11]Wang XY,Song JY,Xie CX,et al.RNA-Seq and genuine traditional Chinese medicine[J].Yao Xue Xue Bao,2014,49(12):1650-1657.

[12]Stankevicius V,Vasauskas G,Bulotiene D,et al.Gene and miRNA expression signature of Lewis lung carcinoma LLC1 cells in extracellular matrix enriched microenvironment[J].BMC Cancer,2016,16(1): 789.

[13]Zhang W,Le TD,Liu L,et al.Predicting miRNA targets by integrating gene regulatory knowledge with expression profiles[J].PLoS One,2016,11(4):e0152860.

[14]Mito JK,Min HD,Ma Y,et al.Oncogene-dependent control of miRNA biogenesis and metastatic progression in a model of undifferentiated pleomorphic sarcoma[J].J Pathol,2013,229(1): 132-140.

[15]Wang X,Zhao J,Huang J,et al.The regulatory roles of miRNA and methylation on oncogene and tumor suppressor gene expression in pancreatic cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012，425(1): 51-57.

[16]Osada H，Takahashi T,Takahashi.Let-7 and miR-17-92:small-sized major players in lung cancer development[J].Cancer Sci,2011,102(1): 9-17.

[17]Xue X,Liu Y,Wang Y,et al.MiR-21 and MiR-155 promote non-small cell lung cancer progression by downregulating SOCS1,SOCS6,and PTEN[J].Oncotarget,2016,7(51):84508-84519.

[18]Kim YH,Lee WK,Lee EB,et al.Combined effect of metastasis-related microRNA,miR-34 and miR-124 family,methylation on prognosis of non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2017,18(1):e13-e20.

[19]Stahlhut C,Slack FJ.Slack,combinatorial action of microRNAs let-7 and miR-34 effectively synergizes with erlotinib to suppress non-small cell lung cancer cell proliferation[J].Cell Cycle,2015,14(13): 2171-2180.

[20]Avci CB,Harman E,Dodurga Y,et al.Therapeutic potential of an anti-diabetic drug,metformin:alteration of miRNA expression in prostate cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(2):765-768.

[21]Cao JX,Lu Y,Qi JJ,et al.MiR-630 inhibits proliferation by targeting CDC7 kinase,but maintains the apoptotic balance by targeting multiple modulators in human lung cancer A549 cells[J].Cell Death Dis,2014，5:1426.

Effect of microRNA on apoptosis induced by maslinic acid in lung cancer cell line A 549

BAI Xue,LI Hui,ZHANG Yue,PENG Yang,HE Ping*

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the biological effect of microRNA on apoptosis induced by maslinic acid in lung cancer cell line A549.Methods A549 cells were treated with maslinic acid and the total RNA was extracted.Expression pattern of microRNA was examined in A549 cells treated with maslinic acid using AFFX miRNA expression microarray.Target proteins were predicted using bioinformatic methods.Results Totally 59 miRNAs were involved in the inhibition effect of maslinic acid on lung cancer cell,of which 23 miRNAs were significantly up-regulated and 36 miRNAs were down-regulated.Bioinformatic analysis predicted that miRNA regulated more than 400 proliferation-related target proteins and more than 300 apoptosis-related target proteins.XIAP is one of target proteins regulated by miR-630.Conclusion Maslinic acid may inhibit A549 cells growth through the regulatory effect of miRNA expression.

Lung cancer;MicroRNA;Maslinic acid

2016-12-23

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院,沈陽(yáng) 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201705004