α-細(xì)辛醚對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡及XIAP、caspase-3表達(dá)的影響*

張 妍，何 航，韓倩倩，王白燕，朱艷琴

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046

α-細(xì)辛醚對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡及XIAP、caspase-3表達(dá)的影響*

張 妍，何 航，韓倩倩，王白燕，朱艷琴#

河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046

#通信作者，女, 1956年11月生，碩士, 教授,研究方向：中藥抗腫瘤，E-mail:jc.zyqin@hactcm.edu.cn

α-細(xì)辛醚；X連鎖凋亡抑制蛋白；caspase-3；凋亡；Eca-109細(xì)胞

目的：觀察α-細(xì)辛醚對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡的影響及XIAP、caspase-3表達(dá)的變化，探討α-細(xì)辛醚的可能作用機(jī)制。方法：Eca-109 細(xì)胞分為5組，分別給予5-氟尿嘧啶(陽(yáng)性對(duì)照組)，25、50、100 mg/L α-細(xì)辛醚(α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組)處理，或僅給予等體積的培養(yǎng)液(空白對(duì)照組)。培養(yǎng)48 h后，行AO/EB染色，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用MTT法、Annexin-V-PI法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡，用Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)空白對(duì)照組、α-細(xì)辛醚中劑量組及高劑量組XIAP、caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的增殖率降低、凋亡率升高(P均<0.05)。與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚中、高劑量組XIAP mRNA及蛋白的表達(dá)均降低,caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)均升高(P均<0.05)。結(jié)論：α-細(xì)辛醚可下調(diào)XIAP的表達(dá)、上調(diào)caspase-3的表達(dá)，從而抑制Eca-109細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。

食管癌是常見惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多因素聯(lián)合作用的結(jié)果。近來(lái)研究[1]表明，凋亡逃避在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，細(xì)胞凋亡減少可導(dǎo)致大量細(xì)胞堆積，細(xì)胞周期延長(zhǎng)，引起惡性腫瘤的發(fā)生和化療藥物耐藥性的形成。X 連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中的一員，XIAP可阻斷caspase誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞發(fā)生凋亡逃避，得以永生化，形成腫瘤細(xì)胞，這也是食管癌等惡性腫瘤發(fā)生化療抵抗的重要原因，因而XIAP抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用成為當(dāng)前腫瘤治療的熱點(diǎn)[2]。α-細(xì)辛醚是一種高效、低毒、價(jià)廉的中藥提取物。作者觀察了α-細(xì)辛醚對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌細(xì)胞 Eca-109增殖和凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)XIAP和caspase-3的表達(dá)情況，初步探討α-細(xì)辛醚的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，從而為α-細(xì)辛醚的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：Eca-109購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)KG189。主要試劑：α-細(xì)辛醚(山西普德藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格2 mg/支)；5-氟尿嘧啶(5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，規(guī)格2 g/L、10 mL/支)；二甲基亞砜(DMSO，天津科密歐化學(xué)試劑公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Amresco公司)； 胎牛血清(杭州四季青公司)；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；Annexin-V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(北京寶賽生物試劑有限公司)；XIAP、Caspase-3兔抗人單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。主要儀器和設(shè)備：CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Reveo公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司XDS-1B型)，PCR 擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf Biophotometer公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) Savant公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 Eca-109細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對(duì)濕度95%條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為5組，分別給予5-FU(陽(yáng)性對(duì)照組)和25、50、100 mg/L α-細(xì)辛醚(α-細(xì)辛醚低、中、高劑量組)處理，空白對(duì)照組只加入等體積的培養(yǎng)液，不加藥物。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后行以下檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取1.2中分組培養(yǎng)48 h的Eca-109細(xì)胞，一部分用于AO/EB染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)學(xué)變化。一部分消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104mL-1，接種于96孔板，每孔200 μL，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，48 h后，加入20 μL 5.00 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去上清，加入150 μL的 DMSO，充分振蕩，使藍(lán)紫色顆粒完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Annexin-V-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1.2中分組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，PBS洗滌后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入培養(yǎng)液，吹打混勻后，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer 懸浮，加入5 μL Annexin-V-FITC混勻后，避光4 ℃孵育 10 min，上機(jī)前5 min加入5 μL PI，補(bǔ)加200 μL的Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)XIAP、Caspase-3蛋白表達(dá)提取1.2中培養(yǎng)48 h的空白對(duì)照組，α-細(xì)辛醚中、高劑量組細(xì)胞總蛋白(前期實(shí)驗(yàn)提示中、高劑量α-細(xì)辛醚誘導(dǎo)凋亡效果更佳)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉2 h，分別加入內(nèi)參β-actin和兔抗人一抗(按1：2 000稀釋)，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(按1：1 000稀釋)，室溫振搖反應(yīng)1 h，洗膜，加入ECL超敏發(fā)光液，室溫孵育3 min，曝光照相，使用Quantityone分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)XIAP、caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量 取1.2中培養(yǎng)48 h的空白對(duì)照組，α-細(xì)辛醚中、高劑量組細(xì)胞，按Trizol抽提法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，進(jìn)行PCR，檢測(cè)XIAP、caspase-3 mRNA的表達(dá)，引物由北京市理化分析測(cè)試中心合成。引物序列如下：β-actin 上游引物序列5’-CCGTCTTCCCCTCCATCG-3’，下游引物序列5’-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度155 bp；XIAP上游引物序列5’-CCGTGCGGTGCTT TAGTTGT-3’，下 游 引 物 序 列5’-TTCCTCGGG TATATGGTGTCTGAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度292 bp；caspase-3上游引物序列5’-CAGTGGAGGCCGACT TCTTG-3’,下 游 引 物 序 列5’-TGGCA CAAAGCGACTGGAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度101 bp。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù) 2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較5組間細(xì)胞增殖情況和凋亡率以及空白對(duì)照組及α-細(xì)辛醚中、高劑量組XIAP、caspase-3 mRNA與蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 α-細(xì)辛醚對(duì)Eca-109細(xì)胞形態(tài)的影響 AO/EB染色后熒光倒置顯微鏡下可見空白對(duì)照組核染色質(zhì)被染成綠色且顯現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)；α-細(xì)辛醚處理后，部分細(xì)胞核染色質(zhì)呈凝結(jié)狀，被染成綠色，另有部分細(xì)胞核染色質(zhì)被染成橘紅色，同時(shí)可見部分細(xì)胞呈半月形。見圖 1。

A：空白對(duì)照組；B：5-FU組；C:α-細(xì)辛醚低劑量組；D：α-細(xì)辛醚中劑量組；E：α-細(xì)辛醚高劑量組。圖1 5組Eca-109細(xì)胞形態(tài)觀察(AO/EB，×200)

2.2 α-細(xì)辛醚對(duì) Eca-109 細(xì)胞增殖能力和凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，5-FU和不同劑量的α-細(xì)辛醚均可抑制 Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，結(jié)果見表1。

表1 各組光密度值和細(xì)胞凋亡率的比較(n=3)

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；△：與α-細(xì)辛醚高劑量組比較，P<0.05；#：組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 α-細(xì)辛醚對(duì) Eca-109 細(xì)胞XIAP、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚處理Eca-109 細(xì)胞48 h后，XIAP蛋白表達(dá)降低、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，結(jié)果見圖2、表2。

1：空白對(duì)照組；2：α-細(xì)辛醚中劑量組；3：α-細(xì)辛醚高劑量組。圖2 3組Eca-109細(xì)胞中XIAP、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 3組細(xì)胞XIAP、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較(n=3)

#：組間兩兩比較，P均<0.05。

2.4 α-細(xì)辛醚對(duì) Eca-109 細(xì)胞XIAP、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚處理Eca-109 細(xì)胞48 h后，XIAP mRNA表達(dá)降低、caspase-3 mRNA表達(dá)升高，結(jié)果見表3。

表3 3組細(xì)胞XIAP、caspase-3 mRNA表達(dá)的比較(n=3)

#：組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)由基因調(diào)控的、主動(dòng)的、程序化死亡過(guò)程[3]，各種凋亡信號(hào)通過(guò)線粒體、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑傳遞信息，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase 活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。與細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)的信號(hào)分子或基因有很多，XIAP就是其中之一。XIAP是凋亡抑制蛋白IAP家族中的一員，具有IAP家族特征性的結(jié)構(gòu)——BIR結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域約由70個(gè)氨基酸組成，位于IAP氨基端，是IAP家族執(zhí)行細(xì)胞凋亡抑制功能的必需氨基酸序列，是IAP與caspase、Smac結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5]。XIAP定位于Xp25，包含N端的BIR 1～3三個(gè)結(jié)構(gòu)域和C 端的RNG鋅指結(jié)構(gòu)域[6]。XIAP在人體的多種組織中表達(dá)，在正常組織中低水平表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯升高[7]，提示XIAP可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

XIAP可通過(guò)以下3個(gè)途徑抑制細(xì)胞凋亡。一是XIAP直接與caspase-3結(jié)合抑制凋亡。凋亡相關(guān)的caspase按其生化特征和功能可分為起始caspase(上游caspase)和效應(yīng)caspase(下游caspase)，起始caspase包括caspase-2、8、9、10，效應(yīng)caspase包括caspase-3、6、7，其中caspase-3是一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，可能是整個(gè)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的必經(jīng)之路[8]。研究[9]表明，XIAP分別通過(guò)BIR 1、BIR 2結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)caspase-3、7結(jié)合，通過(guò)BIR 3-RING鋅指結(jié)構(gòu)與凋亡起始分子caspase-9的活性部位相結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡。二是通過(guò) NF-κB途徑抑制細(xì)胞凋亡[10]。三是通過(guò)參與MAPK 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞凋亡[11]。XIAP的凋亡抑制功能受多種因素的調(diào)節(jié)，其中Smac是最重要的，Smac可以與XIAP的BIR 1、BIR 2結(jié)合，從而破壞BIR 3與上游caspase-9之間的結(jié)合，并破壞Linker-BIR 2與caspase-3、7之間的相互作用，從而解除XIAP對(duì)caspase的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]，可以說(shuō)Smac是天然的XIAP抑制劑。在前期研究[13]中，作者發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醚可激活線粒體通路，導(dǎo)致Smac因子釋放，促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡。該研究顯示，與空白對(duì)照組比較，α-細(xì)辛醚組細(xì)胞凋亡率升高，而XIAP蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低，這表明α-細(xì)辛醚可下調(diào)XIAP表達(dá)，從而誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡。

caspase-3是caspase家族中的重要成員。研究[14]表明，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的多數(shù)因素均需要通過(guò)caspase-3介導(dǎo)執(zhí)行，細(xì)胞凋亡的某些特征性標(biāo)志，如DNA片段化和染色體凝聚等，也與caspase-3有著直接的關(guān)系。該研究顯示，與空白對(duì)照組比較，caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)升高，這表明α-細(xì)辛醚可上調(diào)caspase-3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡。

鑒于多種信號(hào)分子或基因參與凋亡抑制或者逃避，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療藥物耐藥性的形成，因而針對(duì)諸如XIAP等抑制劑的研發(fā)成為腫瘤治療新的熱點(diǎn)，如XIAP反義寡核苷酸抑制劑、XIAP小分子抑制劑等[15]，然限于技術(shù)難度、不良反應(yīng)以及價(jià)格高昂等問題，進(jìn)展緩慢，未在臨床普及應(yīng)用。中藥具有高效、低毒、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。該研究顯示，α-細(xì)辛醚可充當(dāng)天然的XIAP抑制劑，發(fā)揮化療藥的功效，然其作用分子機(jī)制仍不甚明了，尚需深入的研究與探索。

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(2016-08-05收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effect of α-asarone on apoptosis of Eca-109 cells and expressions of XIAP and caspase-3

ZHANGYan,HEHang,HANQianqian,WANGBaiyan,ZHUYanqin

SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046

α-asarone;X-linked inhibitor of apoptosis protein;caspase-3;apoptosis；Eca-109 cell

Aim: To observe the apoptosis-inducing effect of α-asarone on esophageal carcinoma Eca-109 cells and changes of the expressions of XIAP and caspase-3, and explore the underlying mechanism. Methods: Eca-109 cells were allocated into 5 groups, and treated with 5-FU(positive control group), 25，50，100 mg/L α-asarone(low-，medium-，and high- dose α-asarone groups) and culture medium(blank control group),respectively. After 48 h, morphologic changes were observed under inverted fluorescence microscope after AO/EB staining. MTT and Annexin-V/PI method were used to detect cell proliferation and apoptosis. Western blot and real-time quantitative PCR were adopted to detect XIAP and caspase-3 mRNA and protein expressions in blank control group,medium-dose α-asarone group and high-dose α-asarone group. Results: Compared with blank control group, cell proliferation rate in different doses of α-asarone groups and positive control group decreased significantly, while cell apoptosis rate increased significantly(P<0.05).In contrast with blank control group,the expressions of XIAP mRNA and protein decreased significantly, while those of caspase-3 increased significantly in medium- and high- dose α-asarone groups(P<0.05).Conclusion: α-asarone could inhibit Eca-109 cells proliferation and induce cell apoptosis by down-regulating XIAP expression and up-regulating caspase-3 expression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.001

*河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目 072300450030；河南省科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 13A310612；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目 121PCXTD520；河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 16A310021

R735.1