miRNA-182對細胞內鈉離子通道蛋白Nav1.7表達的影響*

李 鳴，蔡偉華，邵金平，王劍南，蘇松雪，李 磊，曹 靖，臧衛東

鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室 鄭州 450001

miRNA-182對細胞內鈉離子通道蛋白Nav1.7表達的影響*

李 鳴，蔡偉華，邵金平，王劍南，蘇松雪，李 磊，曹 靖#，臧衛東#

鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室 鄭州 450001

#通信作者,曹靖，女，1973年3月生，博士，副教授，研究方向：慢性疼痛的分子學機制，E-mail:caojing73@126.com；臧衛東，男，1965年1月生，博士，教授，研究方向：慢性疼痛的分子學機制，E-mail：zwd@zzu.edu.cn

鈉離子通道1.7;miRNA-182

目的：探索miRNA-182對細胞中電壓門控鈉離子通道1.7(Nav1.7)表達的影響及可能機制。方法：構建重組SCN9A 3’UTR雙熒光素酶報告基因載體并與miRNA-182抑制物、類似物或scramble共轉染HEK293細胞，通過熒光素酶活性檢測觀察miRNA-182和SCN9A表達的變化。用谷氨酸鈉刺激PC12細胞并轉染miRNA-182類似物或抑制物，利用原位雜交、免疫熒光共檢測以及蛋白免疫印跡方法檢測細胞中miRNA-182和Nav1.7蛋白的表達。結果：miRNA-182能抑制SCN9A 3’UTR在HEK293細胞中的表達。 Nav1.7和miRNA-182在PC12細胞共表達。 谷氨酸鈉可使PC12細胞中Nav1.7表達增高，miRNA-182的表達降低(P<0.05)；miRNA-182類似物能拮抗谷氨酸鈉的刺激作用。結論：miRNA-182可負調控細胞內Nav1.7蛋白的表達。

電壓門控鈉離子通道1.7(sodium channel protein 1.7，Nav1.7)由SCN9A基因編碼。原發性紅斑肢痛癥[1]、陣發性劇痛癥[2]、先天性無痛癥[3]的發生都與SCN9A基因突變有關。在疼痛機制研究方面，Nav1.7備受關注[4]，Nav1.7表達的調控機制成為目前研究的熱點。 miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子,參與調控基因轉錄后表達[5-6]。miRNA與靶基因信使 RNA的3’端非編碼區(3’UTR)相結合，可以抑制靶基因的表達。經Targetscan軟件預測，miRNA-182與SCN9A 3’UTR有7個堿基的相互配對。既往研究[7-9]證明谷氨酸鈉刺激后PC12細胞內Nav1.7表達顯著升高，但機制尚不明確。因此該研究擬利用雙熒光素酶報告基因以及原位雜交、免疫印跡、免疫熒光等方法，探究miRNA-182對細胞內Nav1.7表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器 PC12細胞和HEK293細胞由鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室儲存。試劑和儀器：谷氨酸鈉(美國Amresco公司),DMEM(美國Hyclone公司),胰蛋白酶(北京Solarbio公司),滅活胎牛血清(美國GIBCO公司)，兔抗大鼠 Nav1.7 單克隆抗體(美國Abcam公司),山羊抗兔結合CY3二抗(美國Jackson公司),lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (美國Promega公司),BCA蛋白定量檢測試劑盒(中國康為世紀公司),SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(中國威奧公司),激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。miRNA-182類似物、抑制物及scramble，重組野生型和突變型SCN9A 3’UTR雙熒光素酶報告基因載體的構建均由上海吉瑪生物公司完成。

1.2 miRNA-182對SCN9A 3’UTR表達的影響

1.2.1 實驗分組 將HEK293細胞以每孔2×105個接種24孔板，細胞密度達50%時進行轉染,轉染前3 h用不含血清和雙抗的培養基代替原有的培養基。實驗分5組。WT組HEK293細胞用脂質體轉染法轉染野生型SCN9A 3’UTR質粒；WT+miRNA-182類似物、WT+miRNA-182抑制物組細胞共轉染野生型SCN9A 3’UTR質粒和miRNA-182類似物(100 pmol/L)、miRNA-182抑制物(100 pmol/L)；MUT+miRNA-182類似物組細胞共轉染突變型SCN9A 3’UTR質粒和miRNA-182類似物(100 pmol/L);WT+scramble組細胞共轉染野生型SCN9A 3’UTR質粒和miRNA-182 scramble。培養6 h后換含體積分數10%胎牛血清和抗生素的DMEM培養基培養。

1.2.2 熒光素酶活性檢測 5組HEK293細胞用含血清培養基培養30 h后，吸去原有培養基，1×PBS沖洗細胞，用裂解液裂解，吹打15 min，收集細胞裂解液，12 000 r/min離心5 min，取上清20 μL測定熒光素酶活性。采用不透光的96孔白板，分別向各孔加入20 μL細胞裂解液，每個樣本3個復孔，上機讀取熒光強度，計算螢火蟲熒光素/海腎素熒光強度的比值，即為熒光素酶活性。

1.3 miRNA-182對谷氨酸鈉刺激的PC12細胞Nav1.7表達的影響

1.3.1 實驗分組 PC12細胞在完全培養基中(包括高糖DMEM培養基、體積分數10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素濃度分別為100 kU/L 和100 μg /L)于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，隔天換液，待細胞密度達到70%～80%時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，繼而傳代培養，4 h后分組處理。空白對照組：PC12細胞繼續在正常高糖DMEM培養基中培養。Glu組：在PC12細胞培養液中加入終濃度為20 nmol/L的谷氨酸鈉[7]。Glu+miRNA-182類似物組：PC12細胞轉染miRNA-182 類似物 4 h后加入終濃度為20 nmol/L谷氨酸鈉繼續培養。miRNA-182抑制物組：PC12細胞轉染miRNA-182 抑制物后用正常DMEM高糖培養基培養。分組培養48 h后，進行相應指標的檢測。

1.3.2 miRNA-182和Nav1.7共檢測 首先采用原位雜交法檢測miRNA-182，然后采用免疫熒光法檢測Nav1.7。將細胞以5×104mL-1接種于24孔板，制備細胞爬片；滴加體積分數 30%H2O2與純甲醇體積比為1：50的混合液室溫放置30 min，用蒸餾水快速洗滌3次；滴加胃蛋白酶室溫消化2 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加預雜交液(20 μL/片)，在38～42 ℃中放置3 h后甩去切片表面液體，勿洗；滴加雜交液(20 μL/片)，在38～42 ℃環境中放置過夜；梯度SSC洗滌，封閉，37 ℃ 30 min雜交，洗滌，完成原位雜交。接著，滴加封閉液于之前完成原位雜交的切片上，室溫封閉1～2 h后甩除表面液體，勿洗;隨后加兔抗大鼠 Nav1.7 單克隆抗體(按1：150稀釋) 20 μL/片4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次；加山羊抗兔結合CY3二抗(按1：200稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗，同上封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖片，采用Image J軟件處理,記錄熒光強度。

1.3.3 Nav1.7的半定量檢測 PC12細胞除去培養基，1×PBS洗滌，加入蛋白裂解液80 μL后將細胞刮下收于EP管中，冰上靜置0.5～1 h，4 ℃條件下1 500 r/min離心15～30 min。取上清，BCA法測蛋白濃度。配制60 g/L分離膠，等蛋白量上樣，電泳(80 V 30 min，120 V 90 min),轉膜，50 g/L脫脂奶封閉2 h，TBS洗5 min×3次，加兔抗大鼠 Nav1.7 單克隆抗體(按1：150稀釋)4 ℃ 過夜，PBS洗5 min×3次，加山羊抗兔結合CY3二抗(按1：1 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL顯色。以β-actin為內對照，每組實驗重復3 次。以目的條帶與β-actin 條帶光密度的比值表示目的蛋白表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0進行統計學分析。各指標的組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 miRNA-182干預后細胞中SCN9A 3’UTR的表達 見表1。表1顯示，miRNA-182 scramble對細胞中野生型SCN9A 3’UTR的表達無影響，miRNA-182類似物可以顯著降低細胞中野生型SCN9A 3’UTR的表達，但對突變型SCN9A 3’UTR的表達無影響。WT+miRNA-182抑制物組SCN9A 3’UTR的表達雖較WT組降低，但高于WT+ miRNA-182類似物組。

表1 熒光素酶活性測定結果比較

F=49.683,P<0.001;*:與WT組比較，P<0.05；#：與WT+ miRNA-182類似物組比較，P<0.05；△：WT+miRNA-182抑制物組比較，P<0.05。

2.2 miRNA-182干預后谷氨酸鈉刺激的PC12細胞中Nav1.7的表達 原位雜交和免疫熒光共染色結果見圖1，Western blot結果見圖2，定量結果見表2。

A：空白對照組； B：Glu組； C:Glu+miRNA-182類似物組;D:miRNA-182抑制物組；1：免疫熒光(紅色)；2：原位雜交(綠色)；3：融合圖片。圖1 共染色結果(×200)

A:空白對照組;B:Glu組;C:Glu+ miRNA-182類似物組;D:miRNA-182抑制物組。圖2 Western blot結果

表2 各組PC12 細胞miRNA-182、Nav1.7表達量比較

*:與空白對照組比較，P<0.05；#：與Glu+ miRNA-182類似物組比較，P<0.05。

從圖1可以看出，miRNA-182(綠色)和Nav1.7(紅色)均在PC12細胞中表達。從表2可以看出，與空白對照組比較，Glu組和miRNA-182抑制物組細胞中miRNA-182熒光強度低，Nav1.7熒光強度和蛋白表達水平高；與Glu組相比較，Glu+miRNA-182類似物組細胞中miRNA-182熒光強度顯著增強且遠強于空白對照組，而Nav1.7熒光強度和蛋白表達水平下降并達到空白對照組水平。

3 討論

電壓門控依賴性鈉離子通道是分布于細胞膜上的一類重要的離子通道,主要由α亞基和β亞基構成，其中α亞基為功能亞單位,包含4個相同的跨越細胞膜的結構域,每個結構域均為6次跨膜螺旋，是介導鈉離子出入的孔道，與神經細胞的興奮性密切相關[8]。現已發現的功能性電壓門控鈉離子通道有9種亞型(Nav1.1至Nav1.9)，其中Nav1.7主要表達于周圍脊神經節和交感神經節，由SCN9A基因編碼，該基因突變可導致多種先天性痛覺異常疾病[10]。因此Nav1.7成為疼痛研究的重要靶點，科學家們力圖研發出特異性抑制或調節Nav1.7的藥物用于鎮痛[11]。由于對Nav1.7調控神經病理性疼痛的具體機制尚不明確，所有研究進展比較緩慢。盡管如此，有研究[10，12]顯示，在單一應用非選擇性鈉離子通道阻滯劑治療遺傳性紅斑性肢痛癥和用卡馬西平治療陣發性劇痛癥的研究中，小分子RNA可以通過抑制或調節Nav1.7的表達而降低脊根節神經元活性并達到緩解疼痛的目的。

疼痛的發生發展中有較多miRNAs的參與[5,13-14]。miRNA可以通過完全或不完全結合mRNA的方式，起到調控靶基因的作用[9,15]。miRNA-96可通過抑制Nav1.3的表達，從而起到緩解CCI模型大鼠的疼痛[16]。鞘內注射miRNA-21抑制劑可有效緩解因周圍神經損傷造成的大鼠神經性疼痛[17]。基于Nav1.7在疼痛中的重要作用[11,18]，該研究試圖尋求能夠調控SCN9A的miRNA，探索Nav1.7調控機制并探尋鎮痛的新方法。

首先，為了篩選與SCN9A 基因相關的miRNAs，作者利用Targetscan發現miRNA-182與SCN9A 存在著密切的相關性，通過構建重組SCN9A 3’UTR雙熒光素酶報告基因載體，進一步證實了miRNA-182與SCN9A之間確實存在密切的靶標關系。然后，作者用谷氨酸鈉刺激PC12細胞觀察Nav1.7蛋白和miRNA-182表達的變化，結果顯示，Nav1.7蛋白表達增高的同時，miRNA-182的表達下調。分別將miRNA-182類似物和抑制物劑轉染谷氨酸鈉刺激組和正常PC12細胞,發現過表達miRNA-182可以逆轉谷氨酸鈉刺激的Nav1.7蛋白高表達，而正常PC12細胞轉染miRNA-182抑制劑后Nav1.7的表達增加，蛋白免疫印跡方法也證實了Nav1.7表達的上述變化。研究結果提示，miRNA-182 能夠抑制Nav1.7蛋白的表達，使Nav1.7保持穩態。

該研究在細胞水平證實了miRNA-182對Nav1.7的負調控作用，這為疼痛的基礎研究提供了新的方向，同時為疼痛的治療提供了新的靶點,下一步將在在體實驗觀察應用miRNA-182調控Nav1.7的表達是否可以緩解神經病理性疼痛。

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(2016-10-18收稿 責任編輯王 曼)

Effect of miRNA-182 on Nav1.7 expression in cells

LIMing,CAIWeihua,SHAOJinping,WANGJiannan,SUSongxue,LILei,CAOJing,ZANGWeidong

DepartmentofHumanAnatomy，SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

sodium channel protein 1.7;miRNA-182

Aim: To investigate the effect of miRNA-182 on the expression of voltage-gated sodium channel 1.7(Nav1.7) in cells and its possible mechanism.Methods: Recombinant double luciferase reporter vector carrying SCN9A 3′UTR was constructed and transfected into HEK293 cells binding with miRNA-182 agomir, antagomir or scramble, and the expressions of miRNA-182 and SCN9A were detected by luciferase assay system. Immunofluorescence,insituhybridization, and western blot were used to detect Nav1.7 and miRNA-182 in PC12 cells treated by glutamate and after transfected with miRNA-182 agomir or antagomir.Results: miRNA-182 could inhibit the expression of SCN9A 3′UTR in HEK293 cells. Nav1.7 and miRNA-182 were co-expressed in PC12 cells. The expression of Nav1.7 in PC12 cells with glutamate stimulation was significantly increased, while that of miRNA-182 was significantly decreased(P<0.05), miRNA-182 agomir could reverse the high expression of Nav1.7 protein in PC12 cells induced by glutamate.Conclusion: miRNA-182 could inhibit the expression of Nav1.7 protein in cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.004

*國家自然科學基金資助項目 81671091,81471144

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