染料木黃酮對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌22RV1細(xì)胞增殖的影響*

李 飛，朱彥鋒，陳靜瑤，周 杰，賀易瓊，余小平

成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系衛(wèi)生學(xué)教研室 成都 610500

染料木黃酮對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌22RV1細(xì)胞增殖的影響*

李 飛，朱彥鋒，陳靜瑤，周 杰，賀易瓊，余小平#

成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系衛(wèi)生學(xué)教研室 成都 610500

#通信作者，男，1970年10月生，博士，教授，研究方向：植物化學(xué)物質(zhì)抗腫瘤分子機(jī)制，E-mail:cyggwsyxp@sina.com

染料木黃酮；去勢(shì)抵抗前列腺癌；增殖；22RV1細(xì)胞

目的：探討大豆異黃酮對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及可能機(jī)制。方法：以不同濃度[0.0、12.5、25.0、50.0、100.0和(或)200.0 μmol/L]的染料木黃酮處理去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞22RV1，在24、48、72 h采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki-67表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)PSA、P53、CyclinD1、PCNA及AR表達(dá)水平。結(jié)果：染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞具有抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，染料木黃酮阻滯細(xì)胞周期于G2/M期(P<0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，染料木黃酮能夠抑制細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示染料木黃酮處理后細(xì)胞中CyclinD1、PCNA、PSA、AR的表達(dá)下降，P53的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論：染料木黃酮能夠抑制22RV1細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞G2/M期及下調(diào)周期蛋白CyclinD1表達(dá)有關(guān)。

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤[1]，在我國發(fā)病率高達(dá)11.0/10萬[2]。前列腺癌是一種雄激素依賴性腫瘤，雄激素剝奪治療是主要治療方法，但剝奪治療1～2 a后，大多數(shù)患者逐漸發(fā)展成為雄激素非依賴前列腺癌，即去勢(shì)抵抗前列腺癌。新近有研究[3-5]提示，大豆異黃酮能夠降低罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，且能通過非性激素途徑抑制前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展[6-7]，但大豆異黃酮對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌的作用尚不明確。該研究旨在探討大豆異黃酮活性成分之一染料木黃酮對(duì)去勢(shì)抵抗前列腺癌22RV1細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 22RV1細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒(南京凱基公司)，胎牛血清(Millipore公司)，BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天公司)，HE染色試劑盒(南京建成公司)，PSA、CyclinD1、PCNA、P53、Ki-67兔抗人單克隆抗體(Abcam公司)，山羊抗兔二抗Alexa Fluor 488(Abcam公司)，AR鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz公司)，β-actin單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，染料木黃酮和溶劑DMSO(Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞生長情況的CCK-8法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的22RV1細(xì)胞接種于96孔板，5 000個(gè)/孔。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，暴露于0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的染料木黃酮，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h，分別加入含CCK-8的培養(yǎng)基100 μL孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度(OD)，波長設(shè)為450 nm，繪制細(xì)胞生長曲線并計(jì)算IC50及細(xì)胞活性，細(xì)胞活性=(OD加藥-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%。

1.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 制作22RV1細(xì)胞爬片，給予0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的染料木黃酮處理72 h，40 g/L多聚甲醛固定30 min，HE染色后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 22RV1細(xì)胞給予0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L染料木黃酮處理72 h，收集細(xì)胞，1 000×g離心5 min，加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，1 000×g離心5 min，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定過夜，1 000×g離心5 min，去除乙醇，加入碘化丙啶緩慢重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Ki-67表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) 將22RV1細(xì)胞接種于6孔板，20 000個(gè)/孔。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，給予0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的染料木黃酮處理細(xì)胞72 h，40 g/L多聚甲醛固定，體積分?jǐn)?shù)0.5%Triton-100通透，體積分?jǐn)?shù)5%BSA常溫下封閉1 h。加入一抗兔抗人Ki-67單克隆抗體，4 ℃孵育過夜, TBST洗滌，加入二抗Alexa Fluor 488，常溫下避光孵育1 h，用DAPI復(fù)染，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并采用Image-Pro Plus進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 PSA、AR、P53、CyclinD1、PCNA蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè) 0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L染料木黃酮處理22RV1細(xì)胞72 h，用PBS清洗后加入裂解液和蛋白酶抑制劑的混合物，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞于EP管。4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清。BCA法蛋白定量，定量后分裝保存于-80 ℃待用。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠并以80 V跑過濃縮膠，120 V 1 h進(jìn)行蛋白分離電泳，100 V恒壓濕轉(zhuǎn)1.5 h，PVDF浸入體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶中封閉，室溫緩慢振蕩1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；加入一抗(兔抗人PSA、 CyclinD1、 PCNA、 P53單克隆抗體，鼠抗人AR、β-actin、GAPDH單克隆抗體；除鼠抗人AR單克隆抗體按1：200稀釋外，余均按1：1 000稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入二抗(按1：4 000稀釋)室溫孵育1.5 h；TBST洗膜3次，每次10 min；凝膠成像儀曝光成像，利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶灰度值和β-actin、GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間細(xì)胞周期、Ki-67、P53、PCNA、CyclinD1、PSA及AR蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞增殖的抑制作用 結(jié)果見圖1。由圖1可知，染料木黃酮能有效抑制22RV1細(xì)胞的增殖，且染料木黃酮處理48 h 的IC50為90.5 μmol/L。

圖1 22RV1細(xì)胞生長曲線

2.2 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果見圖2。由圖2可知，與對(duì)照相比，隨著染料木黃酮濃度的增加，22RV1細(xì)胞體積縮小，且呈單個(gè)分布，胞質(zhì)致密，嗜酸性染色增強(qiáng)，核染加深。

A：0.0 μmol/L組；B：12.5 μmol/L組；C：25.0 μmol/L組；D：50.0 μmol/L組；E：100.0 μmol/L組；F：200.0 μmol/L組。圖2 染料木黃酮對(duì)22RV1 細(xì)胞形態(tài)的影響(HE，×400)

2.3 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞Ki-67表達(dá)的抑制作用 染料木黃酮作用于22RV1細(xì)胞72 h后，Ki-67的表達(dá)隨著染料木黃酮濃度的增加而減弱。見圖3、表1。

1：Ki-67；2：DAPI；A：0.0 μmol/L組；B：12.5 μmol/L組；C：25.0 μmol/L組；D：50.0 μmol/L組；E：100.0 μmol/L組；F：200.0 μmol/L組。圖3 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞Ki-67表達(dá)的影響(免疫熒光，×200)

表1 各組22RV1細(xì)胞Ki-67相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

F=1 041.636,P<0.001;*：與0.0 μmol/L組比較，P<0.05；#：與12.5 μmol/L組比較，P<0.05；△：與25.0 μmol/L組比較，P<0.05；▲：與50.0 μmol/L組比較，P<0.05。

2.4 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞周期的影響 染料木黃酮處理22RV1細(xì)胞72 h后，G2/M期細(xì)胞隨著染料木黃酮濃度的增加而增多，而G1/G0期及S期的細(xì)胞減少(表2)。

表2 不同濃度染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞周期的影響(n=3) %

*：與0.0 μmol/L組比較，P<0.05；#：與12.5 μmol/L組比較，P<0.05；△：與25.0 μmol/L組比較，P<0.05；▲：與50.0 μmol/L組比較，P<0.05；▼：與100.0 μmol/L組比較，P<0.05。

2.5 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞中P53、PCNA、CyclinD1、PSA及AR表達(dá)的影響 染料木黃酮處理22RV1細(xì)胞72 h后，22RV1細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、PCNA、PSA及AR的表達(dá)水平隨著染料木黃酮濃度的增高而逐漸降低，而P53的表達(dá)水平隨著染料木黃酮濃度的增高而逐漸上升。見圖4、5和表3。

1～5：分別為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L組。圖4 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞PSA表達(dá)的影響

1～5：分別為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L組。圖5 染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞AR、P53、CyclinD1、PCNA表達(dá)的影響

表3 各組22RV1細(xì)胞PSA、P53、CyclinD1、PCNA及AR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

*：與0.0 mol/L組比較，P<0.05；#：與12.5 μmol/L組比較，P<0.05；△：與25.0 μmol/L組比較，P<0.05；▲：與50.0 μmol/L組比較，P<0.05。

3 討論

大豆異黃酮是一類廣泛存在于豆類中的天然黃酮類化合物，具有多種生物活性，包括緩解更年期綜合征，預(yù)防女性骨質(zhì)疏松，調(diào)節(jié)脂代謝，降低乳腺癌及前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等[8]。近年來，大豆異黃酮抗前列腺癌功能受到廣泛關(guān)注[9-11]。已有資料[12]顯示，大豆異黃酮可通過誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖、增敏化療藥物效果、拮抗雄激素介導(dǎo)的信號(hào)通路等途徑抗前列腺癌。該研究結(jié)果顯示，大豆異黃酮的主要活性單體染料木黃酮能顯著抑制22RV1細(xì)胞增殖。

染料木黃酮處理22RV1細(xì)胞48 h 時(shí)IC50為90.5 μmol/L，與ZHANG等[13]的研究結(jié)果略有差異，這種差異可能是22RV1細(xì)胞對(duì)染料木黃酮敏感性較低造成的。HE染色結(jié)果顯示，在高濃度時(shí)，22RV1細(xì)胞具有凋亡趨勢(shì)，這與DONG等[14]發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡相符。Ki-67常用于檢測(cè)惡性腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)，Ki-67表達(dá)增加說明腫瘤細(xì)胞增殖活躍[15]。該研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮作用后，22RV1細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)明顯減弱，進(jìn)一步證實(shí)染料木黃酮對(duì)22RV1細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

細(xì)胞周期調(diào)控異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，形成永生性細(xì)胞從而導(dǎo)致腫瘤。該研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮可使22RV1細(xì)胞阻滯于G2/M期。而有研究[16]發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮在10.0和25.0 μmol/L時(shí)可使乳腺癌細(xì)胞MCF-7 阻滯于G1/G0期; SHEN等[17]研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮(<25.0 μmol/L)可阻滯LNCaP細(xì)胞于G1/G0期，這種差異可能與染料木黃酮的濃度有關(guān)。而ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮在濃度為50.0～100.0 μmol/L時(shí)對(duì)HCT-116/SW-480細(xì)胞的G2/M期具有明顯的阻滯作用。KANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的染料木黃酮可增強(qiáng)LNCaP細(xì)胞對(duì)低劑量放療的敏感性，使G2/M期細(xì)胞的比例增加。以上說明染料木黃酮能夠通過阻滯G2/M期來抑制22RV1細(xì)胞的增殖。

PSA是前列腺癌特異性標(biāo)志物，其表達(dá)升高可較敏感地提示腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移等。前列腺癌患者接受去雄激素治療后PSA水平下降，但轉(zhuǎn)為去勢(shì)抵抗前列腺癌后血清中PSA水平回升。作者發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能降低22RV1細(xì)胞中PSA的表達(dá)，說明染料木黃酮可通過抑制PSA表達(dá)發(fā)揮抗去勢(shì)抵抗前列腺癌的作用。另一方面PSA也是臨床相關(guān)的AR反應(yīng)性基因，其常用于監(jiān)測(cè)前列腺癌患者的治療反應(yīng)、預(yù)后和進(jìn)展[20]。AR通過在PSA的啟動(dòng)子區(qū)域中結(jié)合AR響應(yīng)元件來調(diào)節(jié)PSA轉(zhuǎn)錄[21]。該研究結(jié)果顯示，染料木黃酮能夠下調(diào)22RV1細(xì)胞中AR的表達(dá)，這提示染料木黃酮有可能作用于AR信號(hào)通路進(jìn)而抑制22RV1細(xì)胞PSA的表達(dá)，其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

PCNA是DNA聚合酶δ的輔助因子，PCNA的合成和表達(dá)與細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)。cyclinD1是一種原癌基因，是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合后，可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，繼而發(fā)生分裂與增殖，其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化。研究[22]發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能夠抑制DU145細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)。該研究中作者發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能抑制PCNA和CyclinD1的表達(dá)，說明染料木黃酮抑制22RV1細(xì)胞增殖可能是通過下調(diào)PCNA和CyclinD1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。p53是一種抑癌基因，前列腺癌細(xì)胞中P53表達(dá)普遍降低，作者發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能上調(diào)P53表達(dá)，說明染料木黃酮能通過上調(diào)P53表達(dá)來抑制22RV1細(xì)胞增殖。ZHAO等[23]研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮在10.0 μmol/L時(shí)能上調(diào)P53的表達(dá)來阻滯LNCaP細(xì)胞于G2/M期，與該研究中的作用濃度基本相符。

去勢(shì)抵抗前列腺癌是前列腺癌發(fā)展的后期階段，內(nèi)分泌治療是去勢(shì)抵抗前列腺癌治療的主流方法之一，但如何提升內(nèi)分泌治療的效果是當(dāng)前臨床應(yīng)用的主要問題。該研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮能夠通過阻滯細(xì)胞G2/M期及調(diào)節(jié)相關(guān)周期蛋白來抑制22RV1細(xì)胞的增殖及PSA表達(dá)，為去勢(shì)抵抗前列腺癌的內(nèi)分泌治療提供了新的思路。

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(2016-11-04收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of genistein on proliferation of castrate-resistant prostate cancer 22RV1 cells

LIFei,ZHUYanfeng,CHENJingyao,ZHOUJie,HEYiqiong,YUXiaoping

DepartmentofHygiene，DivisionofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500

genistein;castrate-resistant prostate cancer;proliferation;22RV1 cell

Aim: To explore the effect of soy isoflavones,genistein on the proliferation of castration-resistant prostate cancer 22RV1 cells and its potential mechanism. Methods: 22RV1 cells were treated with genistein at 0.0, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0, and/or 200.0 μmol/L for 24, 48, 72 hours followed by determination of their proliferation by CCK-8 assay, and their cell cycle by flow cytometry. The expression of Ki-67 was detected by immunocytochemistry. The expressions of PSA, CyclinD1, PCNA, P53 and AR protein were detected by Western blot. Results: Genistein had inhibitory effect on 22RV1 cells. Flow cytometry results showed that the cell cycle in the genistein treated groups was arrested at G2/M phase(P<0.05). The expression of Ki-67 in the genistein-treated groups was significantly lower than that in the control group(P<0.05). The results of Western blot showed that genistein could reduce CyclinD1, PCNA, PSA, and AR expressions,and increase P53 expression(P<0.05). Conclusion: Genistein could inhibit the proliferation of 22RV1 cells via arresting the cell cycle and reducing the expression of CyclinD1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.005

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81402678，81573154；四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 2014TD0021；成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 201513705027

R737.25