上皮性卵巢癌中Let-7a及其靶基因HMGA2、Cyclin D1的表達*

李 莉，賈 慧，李保平，李曉珍，孫 瑋，臧星卉，李紅雨，DUAN Zhenfeng，郭玉琪

1)鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)美國哈佛大學麻省總醫院肉瘤實驗室 美國 波士頓 MA02114 3)河南省婦科腫瘤納米醫學國際聯合實驗室 鄭州 450003

上皮性卵巢癌中Let-7a及其靶基因HMGA2、Cyclin D1的表達*

李 莉1)，賈 慧1)，李保平1)，李曉珍1)，孫 瑋1)，臧星卉1)，李紅雨1)，DUAN Zhenfeng2)，郭玉琪1，3)#

1)鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)美國哈佛大學麻省總醫院肉瘤實驗室 美國 波士頓 MA02114 3)河南省婦科腫瘤納米醫學國際聯合實驗室 鄭州 450003

#通信作者，女，1964年1月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：卵巢癌與多藥耐藥，E-mail：yuqi-guo@163.com

上皮性卵巢癌；let-7a；高遷移率蛋白A2；細胞周期蛋白D1

目的：探討上皮性卵巢癌患者血漿和組織中let-7a的表達水平及意義。方法：采集48例上皮性卵巢癌患者的血漿和癌組織、同時期與卵巢癌患者年齡性別匹配的23例健康體檢者的血漿和26例因子宮等良性疾病切除的正常卵巢組織，采用qRT-PCR法檢測血漿及組織中let-7a和高遷移率蛋白A2(HMGA2)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1) mRNA的表達，采用免疫組化法檢測組織中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表達。結果：卵巢癌患者血漿及組織中let-7a的表達均低于正常(P<0.05)，血漿及組織中let-7a的表達無相關性(r=0.163,P=0.270)；以血漿let-7a水平診斷卵巢癌的ROC曲線下面積為0.826(95%CI為0.728～0.923)。HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白在癌組織中的表達高于正常(P<0.05)。組織中let-7a和HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表達與FIGO分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。卵巢癌組織中let-7a與HMGA2、Cyclin D1 mRNA的表達呈負相關(r=-0.729、-0.735,P<0.001)。結論：血漿let-7a表達水平對上皮性卵巢癌有一定的診斷價值；Let-7a及其靶基因HMGA2和Cyclin D1共同參與了上皮性卵巢癌的發生發展。

卵巢癌在女性生殖系統腫瘤中發病率居于第四位，病死率卻高居首位，目前只有25%的患者可以在FIGO(2013)Ⅰ、Ⅱ期被確診，超過70%的患者確診時已是晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ期)，晚期患者的5 a生存率約為30%[1]。對于晚期患者，治療最主要的障礙是缺乏早期診斷指標和多藥耐藥的發生[2-3]。miRNA作為重要的基因表達調控分子，通過與靶點mRNA堿基互補配對，降解相應的mRNA或阻遏其翻譯過程，從而調控基因表達，與腫瘤發生、發展和化療耐藥關系密切[4]。最近研究[5]發現，從人體液循環中可以檢測到miRNA，提示miRNA可能成為一種新的診斷指標，輔助腫瘤的早期診斷與治療。let-7a是miRNA家族中的一員，其在多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌組織中表達下調[6-7]。研究[3,8]證實，高遷移率蛋白A2(HMGA2)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)作為let-7a下游的靶點，與惡性腫瘤的發生、組織學類型、分化程度、侵襲性及患者預后關系密切。該研究對上皮性卵巢癌患者血漿及腫瘤組織中let-7a、HMGA2、Cyclin D1的表達進行了分析，評估血漿let-7a對上皮性卵巢癌的診斷價值，探討其在卵巢癌發生發展過程中可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2014年9月至2016年5月于鄭州大學第三附屬醫院就診的上皮性卵巢癌患者48例(卵巢癌組)，均經術后病理證實診斷，年齡22～76歲；FIGO分期Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期11例；漿液性囊腺癌22例，黏液性囊腺癌18例，子宮內膜樣癌6例，透明細胞癌2例；無淋巴結轉移19例，有淋巴結轉移29例；術前均未行化療或放療。采集患者血液及手術當日采集的適量癌組織標本。收集同時期與卵巢癌組患者年齡、性別匹配的23例健康體檢者的血液和同期26例因子宮良性病變等原因行卵巢切除術者的正常卵巢組織(術后經病理證實)為對照。

1.2 標本處理

1.2.1 血液 于術前或體檢當天收集2 mL空腹肘靜脈血于EDTA抗凝管中，3 000×g離心10 min，將上層血漿轉移至EP管中，以12 000×g離心15 min，取上層血漿300 μL用于相關指標的檢測。

1.2.2 組織 將手術當天收集的組織標本用生理鹽水沖洗干凈，分為兩份，一份立即置于-80 ℃冰箱中保存備用，另一份甲醛固定。

1.3 let-7a及HMGA2、Cyclin D1 mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR法檢測血漿和組織中let-7a以及組織中HMGA2、Cyclin D1 mRNA的表達。Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，Quant Script RT試劑盒、Real Master Mix購自日本TOYOBO公司。 let-7a特異性引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，其余均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。將離心后的血漿及液氮研磨后的組織標本采用Trizol法提取總RNA，反轉錄生成cDNA。PCR反應體系20 μL:cDNA 2 μL, 10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，1×SYBR?Green Real time PCR Master Mix 10 μL，蒸餾水6.4 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s(40個循環)。以U6為let-7a的內參，以GAPDH為HMGA2和Cyclin D1的內參。目的RNA表達水平以2-ΔΔCT計算。重復實驗3次。

1.4 HMGA2、Cyclin D1蛋白的檢測 采用免疫組化SP法檢測，按照試劑盒說明書操作。SP試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人HMGA2多克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體為美國Abcam公司產品。染色完成后，于倒置顯微鏡下觀察。胞核或胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒物為HMGA2、Cyclin D1蛋白陽性細胞。選取5個高倍視野(×400)，每個視野內計數100個細胞。按染色強度評分：棕褐色3分，棕黃色2分，淡黃色1分，無黃色顆粒0分；按陽性細胞百分比評分：0～為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。兩項評分相乘，0～3分為陰性，3～6分為陽性。

表1 引物序列

1.5 統計學處理 采用SPSS 21.0進行統計學處理。對照和卵巢癌組let-7a及HMGA2、Cyclin D1 mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗或校正t檢驗。不同臨床病理特征上皮性卵巢癌組織中let-7a表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，HMGA2和Cyclin D1蛋白陽性表達率的比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析評估組織中let-7a與HMGA2、Cyclin D1 mRNA表達的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 卵巢癌患者let-7a的表達情況

2.1.1 卵巢癌和對照組血漿和組織中let-7a表達水平的比較 見表2。卵巢癌組血漿和組織中let-7a表達水平均低于對照組，未發現卵巢癌患者血漿和組織中let-7a的表達有相關性(r=0.163,P=0.270)。以血漿let-7a表達水平診斷上皮性卵巢癌的ROC曲線見圖1，結果顯示，AUC(95%CI)=0.826(0.728～0.923)，提示血漿let-7a表達水平對上皮性卵巢癌有一定診斷價值。

2.1.2 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌組織中let-7a表達的比較 見表3。FIGOⅢ、Ⅳ期，有淋巴結轉移者血漿let-7a表達水平低于FIGOⅠ、Ⅱ期或無轉移者。

表2 卵巢癌和對照組血漿和組織中let-7a表達水平的比較

*：對照組組織樣本量為26，血漿樣本量為23；#：校正t值。

圖1 ROC曲線

表3 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌組織中let-7a表達水平的比較

2.2 卵巢癌患者癌組織中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表達

2.2.1 卵巢癌和對照組組織中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達的比較 見圖2、表4。卵巢癌組組織中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達均高于對照組。

A:子宮內膜樣癌組織中HMGA2蛋白陽性表達;B:正常卵巢上皮組織中HMGA2蛋白陰性表達；C:漿液性囊腺癌組織中Cyclin D1蛋白陽性表達;D:正常卵巢上皮組織中Cyclin D1蛋白陰性表達。圖2 卵巢癌及正常卵巢上皮組織中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表達(SP,×400)

表4 兩組組織中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達水平的比較

*:校正t值。

2.2.2 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌組織中HMGA2、Cyclin D1蛋白表達的比較 見表5。癌組織中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表達與上皮性卵巢癌的FIGO分期、淋巴結轉移有關，而與患者年齡、分化程度及組織學類型均無關。

表5 不同臨床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌組織中HMGA2和Cyclin D1蛋白表達水平的比較

2.3 上皮性卵巢癌組織中let-7a與HMGA2、Cyclin D1 mRNA表達的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，let-7a與HMGA2、Cyclin D1 mRNA表達均呈負相關(r=-0.729、-0.735,P<0.001)。

3 討論

上皮性卵巢癌是一種高度異質性疾病，病因仍不明確，如何從分子層面揭示其發病機制、尋找潛在的腫瘤標志物和治療靶點是目前研究的熱點與難點。

研究[9-11]發現，let-7a在多種惡性腫瘤中呈低表達，如喉癌、外陰鱗狀細胞癌、肝癌等，是一種潛在的抑癌基因。miRNA可在血液循環中穩定存在，有可能成作為潛在的腫瘤標志物。該研究結果提示，卵巢癌患者血漿let-7a表達水平明顯低于正常，進一步建立以上皮性卵巢癌患者血漿let-7a表達水平診斷卵巢癌的ROC曲線，結果顯示，AUC為0.826，提示血漿let-7a表達水平對卵巢癌有較高的診斷價值，可能成為卵巢癌的診斷標志物，與孟偉偉等[12]的報道一致。

HMGA2是一種非組蛋白染色體蛋白，參與轉錄、分化和胚胎發育等生理過程，同時還與許多人類腫瘤的發生發展密切相關。HMGA2與上皮間質轉化(EMT)過程關系密切，參與多條EMT相關信號通路(如TGF-β/Smad3信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等)，是EMT發生過程中的一個關鍵分子。Cyclin D1編碼基因位于11q13，有5個外顯子，全長約15 kb，作為公認的原癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化。HMGA2和Cyclin D1均為let-7a的靶基因[3,13-14]。該研究結果顯示，let-7a在卵巢癌組織中的表達水平明顯低于正常卵巢組織，而HMGA2和Cyclin D1表達水平明顯高于正常卵巢組織，且三者表達均與FIGO分期、淋巴結轉移有關；癌組織中Let-7a與HMGA2、Cyclin D1 mRNA表達呈負相關。推測let-7a可能協同靶基因參與了卵巢癌的發生發展。let-7a在腫瘤發生的早期缺失，類似于反向胚胎發育的過程[15]。Let-7a低水平表達可促進HMGA2的轉錄和翻譯，HMGA2可能進一步通過TGF-β/Smad3或Wnt/β-catenin信號通路介導EMT，參與上皮性卵巢癌的侵襲與進展。Let-7a的缺失還可促進Cyclin D1表達升高，加速腫瘤細胞由G1期向S期轉化，進一步激活PI3K/AKT通路，促進腫瘤生長。

綜上所述，作者認為，血漿let-7a表達水平可以用于上皮性卵巢癌的輔助診斷；let-7a及其靶基因HMGA2和Cyclin D1參與了上皮性卵巢癌的發生發展。

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(2016-10-11收稿 責任編輯王 曼)

Expressions of let-7a and its target genes HMGA2,Cyclin D1 in epithelial ovarian cancer

LILi1),JIAHui1),LIBaoping1),LIXiaozhen1),SUNWei1),ZANGXinghui1),LIHongyu1),DUANZhenfeng2),GUOYuqi1,3)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SarcomaBiologyLaboratory,MassachusettsGeneralHospital,HarvardUniversity,BostonMA02114 3)InternationalJointLaboratoryforGynecologicalOncologyNanomedicineofHenanProvince,Zhengzhou450003

epithelial ovarian carcinoma;let-7a;HMGA2;Cyclin D1

Aim: To detection the expressions of let-7a in plasma and tissue of the epithelial ovarian carcinoma(EOC) patients and to explore the clinical significance. Methods: The plasma and tissue samples of 48 patiens with EOC, the plasma samples of 23 healthy controls, and the tissue of 26 cases of normal ovarian(the control) were collected to detected the expressions of let-7a, HMGA2, and Cyclin D1 mRNA by qRT-PCR. The expressions of HMGA2 and Cyclin D1 protein in the tissue were detected using immunohistochemical SP method. Results: The expression level of let-7a in plasma and tissue of the EOC group was significantly lower compared with the controls(P<0.05).The expression level of let-7a in plasma had no correlation with that in tissue(r=0.163,P=0.270).AUCof ROC about the let-7a plasma level for EOC diagnosis was 0.826(95%CIwas 0.728-0.923).The expressions of HMGA2 and Cyclin D1 mRNA and protein were significantly higher in EOC tissue compared with the control (P<0.05).The expressions of let-7a,HMGA2 and Cyclin D1 in EOC tissue were significantly associated with the FIGO stage and lymph node metastasis(P<0.05).The expression of let-7a was negatively correlated with the mRNA level of HMGA2(r=-0.729,P<0.05) and that of Cyclin D1(r=-0.735,P<0.05).Conclusion: The plasma level of let-7a is valuable for the EOC diagnosis;let-7a with HMGA2 and Cyclin D1 may be involved in the occurrence and development of EOC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.006

R725.4

*河南省高校科技創新團隊項目 16IRTSTHN018；國家自然科學基金面上項目 81572574