遠志提取物對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力的干預效果*

彭 芳，崔淵博，宋文穎，張家薇，劉俊保，關(guān)方霞

1)鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校臨床醫(yī)學系 鄭州 450064 2)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心 鄭州 450007 3)鄭州大學人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 4)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

遠志提取物對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力的干預效果*

彭 芳1)，崔淵博2)，宋文穎1)，張家薇1)，劉俊保3)#，關(guān)方霞4)#

1)鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校臨床醫(yī)學系 鄭州 450064 2)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心 鄭州 450007 3)鄭州大學人民醫(yī)院中醫(yī)科 鄭州 450003 4)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

#通信作者:劉俊保，男，1966年3月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向:中西醫(yī)結(jié)合，E-mail:Liu-371@sohu.com; 關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干細胞與再生醫(yī)學、神經(jīng)認知及調(diào)控，E-mail:guanfangxia@126.com

遠志提取物；阿爾茨海默病；學習記憶能力；小鼠

目的：探討遠志提取物對阿爾茨海默病(AD)小鼠學習記憶能力的影響。方法：將28只6月齡雄性AD模型小鼠隨機均分為4組，對照組和A、B、C組。A、B和C組小鼠連續(xù)3個月分別口服遠志提取物50、100、200 mg/(kg·d)，對照組小鼠口服等量溶劑。3個月后，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力，采用ELISA法測定小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量及β分泌酶1(BACE1)、γ分泌酶活性，分別采用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測小鼠海馬組織中腦啡肽酶(NEP)、胰島素降解酶(IDE)、MMP-9 mRNA及蛋白的表達水平，采用Western blot法檢測小鼠海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受體B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)的表達水平。結(jié)果：與對照組相比，C組小鼠穿越平臺次數(shù)增加、逃避潛伏期縮短(P<0.05)；A、B、C組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量降低，NEP、IDE mRNA及蛋白表達水平升高，BDNF、p-TrkB及p-CREB蛋白表達水平升高(P均<0.05)，且C組小鼠上述指標的變化更明顯(P<0.05)。而3組小鼠海馬組織中BACE1和γ分泌酶活性、MMP-9表達及TrkB、CREB蛋白表達水平無變化(P>0.05)。結(jié)論：遠志提取物可有效改善AD小鼠的學習記憶能力，促進Aβ降解與調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路可能是其分子作用機制。

Effect of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化的疾病，以進行性學習記憶能力減退、語言功能障礙及人格改變等為主要臨床表現(xiàn)。腦部病理特征主要包括β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)沉積形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失、炎癥反應(yīng)等[1]。 AD的發(fā)病機制復雜，可能涉及多條信號調(diào)節(jié)途徑，迄今仍無特效療法。采用具有毒副作用小、效果良好、多靶點作用的傳統(tǒng)中藥進行AD干預治療的研究越來越廣泛，可能成為有效治療AD的臨床策略[2]。遠志提取物源自益智健腦中藥遠志，含有皂苷、寡糖脂類等多種活性成分，具有提高記憶、抗炎、抗衰老等神經(jīng)保護作用。目前研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，遠志提取物可明顯提高AD模型小鼠的學習記憶能力并改善腦部Aβ沉積，但其作用機制仍不明確。該研究采用遠志提取物干預AD模型小鼠，從行為功能學、生化與分子生物學水平觀察干預效果并探討可能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 遠志購自山西亳州百川藥業(yè)有限公司。遠志提取物由遠志經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇浸泡、超聲破碎、殘渣過濾、茄型瓶旋蒸得到的膏狀提取物。經(jīng)聚乙二醇加蒸餾水溶解獲得[6-7]。Aβ40、Aβ42、β分泌酶1(BACE1)與γ-分泌酶ELISA檢測試劑盒，勻漿器，T-PER試劑等均購自Thermo Fisher公司；Trizol，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；β-actin、腦啡肽酶(neprilysin, NEP)、胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受體B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)兔抗鼠一抗，羊抗兔二抗，PVDF膜，脫脂奶粉，發(fā)光試劑盒等均購自Sigma公司。

1.2 動物來源及實驗分組 清潔級C57BL/6 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學動物所，合籠繁殖，飼養(yǎng)于全自動獨立送風籠具，選取6月齡、經(jīng)PCR分子鑒定為APP+的雄性仔鼠用于實驗。將28只雄性APP+小鼠(體重24～30 g)隨機均分為4組，每組7只。A、B和C組小鼠口服200 μL(1次/d)遠志提取物，劑量分別為50、100、200 mg/kg，持續(xù)3個月；對照組口服200 μL溶劑。

1.3 小鼠學習記憶能力檢測 3個月連續(xù)干預后，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力。水迷宮水池直徑為120 cm，高度為40 cm，共4個象限，平臺直徑和高度分別為15 cm、28 cm。平臺首先放在第一象限，水面高度略沒過平臺(0.5～1.0) cm，水溫控制在(25±1) ℃。首先進行6 d的空間適應(yīng)性練習，小鼠在每天固定時間段內(nèi)入水練習2次，每次60 s，然后開始正式實驗，整個實驗階段需保持周圍環(huán)境不變。空間探索實驗：以組為單位將小鼠依次從水迷宮4個不同象限放入水池，采集器自動采集記錄每只小鼠的運動軌跡及逃避潛伏期、穿過平臺次數(shù)。反向探索實驗：將平臺位置對調(diào)位于第Ⅳ象限，將小鼠依次從4個不同象限放入水池，觀察并記錄上述指標。

1.4 小鼠海馬組織中Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性檢測 水迷宮實驗結(jié)束后，處死小鼠，立即分離海馬組織，在勻漿器中加入一定量的T-PER試劑(含有蛋白酶抑物)制備腦組織勻漿。勻漿經(jīng)4 ℃、16 000 r/min離心1 h，收集上清液并測總蛋白濃度,用于可溶性Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性測定。離心后剩余的不溶物用體積分數(shù)70%甲酸溶液重懸，室溫16 000 r/min離心1 h，收集上清液測定總蛋白濃度，用于檢測不溶性Aβ40、Aβ42含量。ELISA操作按照試劑盒說明書進行。

1.5 小鼠海馬組織中NEP、IDE與MMP-9 mRNA的檢測 采用Trizol法提取海馬組織總RNA，測定濃度和純度并進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測完整性。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg 總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用ABI 7500 Real Time PCR System進行實時熒光定量PCR。每管反應(yīng)體系為20 μL，每個反應(yīng)重復3次。反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后觀察擴增曲線和熔解曲線并記錄Ct值。目的mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt進行計算。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.6 小鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。分離小鼠海馬組織，液氮研磨充分，加入RIPA與PMSF(兩者體積比100：1)冰上裂解，提取總蛋白，測定濃度。每個樣本取300 μg總蛋白，加入Loading Buffer，100 ℃水浴10 min使蛋白變性，變性后的蛋白于-20 ℃保存或直接上樣檢測。每個蛋白樣品依次經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉，加β-actin(內(nèi)參)、NEP、IDE、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB、CREB、p-CREB一抗及二抗雜交，加發(fā)光劑，由成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶并測灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較4組間相關(guān)指標差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠學習記憶能力的比較 見表2。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，C組小鼠穿越平臺次數(shù)增加、逃避潛伏期縮短(P均<0.05)。

表2 Morris水迷宮實驗結(jié)果

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

2.2 4組小鼠海馬組織中Aβ40、Aβ42含量比較 見表3。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量均下降，且B組和C組不溶性Aβ40、Aβ42含量低于A組(P均<0.05)。

表3 4組小鼠海馬組織中Aβ含量 μg/g

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05。

2.3 4組小鼠海馬組織中BACE1與γ-分泌酶活性的比較 見表4。4組BACE1與γ-分泌酶活性差異無統(tǒng)計學意義。

表4 4組小鼠海馬組織中BACE1與γ-分泌酶活性 U/mg

2.4 4組小鼠海馬組織中NEP、IDE、MMP-9 mRNA及蛋白表達水平的比較 見圖2、表5。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中NEP、IDE mRNA及蛋白表達水平上調(diào)(P均<0.05)，C組上調(diào)更明顯(P<0.05)；而4組MMP-9 mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 Western blot檢測小鼠海馬組織中NEP、IDE及MMP-9 蛋白

表5 4組小鼠海馬組織中NEP、IDE和MMP-9 mRNA及蛋白的表達

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

2.5 4組小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達水平 見圖3、表6。與對照組相比，A、B、C組小鼠海馬組織中BDNF、p-TrkB和p-CREB蛋白表達水平上調(diào)(P均<0.05)，其中C組上述3種蛋白表達水平上調(diào)最顯著(P均<0.05)；而4組間TrkB和CREB蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達

表6 4組小鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白的表達

*：與對照組相比，P<0.05；#：與A組相比，P<0.05；△：與B組比較，P<0.05。

3 討論

Aβ由APP經(jīng)β-分泌酶與γ-分泌酶切割形成，產(chǎn)生毒性強的Aβ40與Aβ42，可溶性Aβ40、Aβ42可直接削弱突觸功能，由可溶性Aβ40、Aβ42聚合形成的不溶性Aβ40、Aβ42則主要沉積在腦部海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)形成老年斑，損害神經(jīng)元，引起認知功能障礙[8-10]。因此，減少Aβ40、Aβ42含量曾經(jīng)被認為是治療AD的策略之一。但由于AD發(fā)病機制復雜，其發(fā)病過程可能有多條通路介導，僅針對減少Aβ而設(shè)計開發(fā)的藥物如分泌酶抑制劑及抗Aβ的單克隆抗體等并不能有效地改善AD的臨床癥狀且具有一定的副作用[11-12]。

遠志作為一種常見的益智類傳統(tǒng)中藥，其提取物含有遠志皂苷等多種活性成分，具有安神益智、祛痰、消炎消腫等功效。近年來研究[2,5,13]發(fā)現(xiàn)，采用遠志提取物干預可明顯提高AD模型小鼠的空間學習記憶能力及降低Aβ水平，提示遠志提取物用于治療AD具有良好的應(yīng)用前景。但遠志提取物有效改善AD學習記憶能力及減少Aβ水平的具體作用機制目前尚不明確，且其對AD的干預效果是否與用藥劑量有關(guān)目前尚無定論。因此，該研究采用不同劑量的遠志提取物干預6月齡APP+小鼠持續(xù)3個月后，在從行為功能學水平和生化與分子生物學水平觀察干預效果并探討可能的作用機制。動物模型在6月齡左右開始在腦部海馬區(qū)出現(xiàn)Aβ沉積，9月齡Aβ沉積明顯增多[14]。

Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，200 mg/kg遠志提取物干預APP+小鼠3個月可有效提高其學習記憶能力,表現(xiàn)為逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加。各干預組小鼠海馬組織中可溶性與不溶性Aβ40、Aβ42含量均低于對照組，表明遠志提取物可有效降低APP+小鼠海馬中的Aβ水平。為探究Aβ含量的降低是由于Aβ生成的減少還是其降解的增加，研究中進一步檢測了Aβ 生成酶BACE1和γ-分泌酶的活性及與Aβ降解密切相關(guān)的3個基因NEP、IDE、MMP-9 mRNA與蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，各干預組小鼠海馬組織中BACE1、γ-分泌酶活性及MMP-9表達水平無明顯變化，而NEP和IDE表達水平顯著提高。NEP和IDE均屬于鋅金屬肽酶，研究[15]發(fā)現(xiàn)，隨年齡的增加或給予AD小鼠NEP或IDE抑制劑，均可導致Aβ沉積。遠志提取物可能通過升高NEP和IDE表達水平以促進Aβ降解，進而減少Aβ沉積。

海馬組織中BDNF/TrkB通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各干預組小鼠海馬組織中BDNF、p-TrkB與p-CREB蛋白的表達量增加，而TrkB與CREB蛋白表達水平無明顯變化。BDNF的上調(diào)與海馬神經(jīng)再生及突觸功能重塑關(guān)系密切，促進BDNF的表達也是干預AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在策略之一。BDNF受體TrkB的活化，具有誘導神經(jīng)細胞增殖和存活的作用，在神經(jīng)元受損后的海馬神經(jīng)再生中起至關(guān)重要的作用[16]。CREB是海馬神經(jīng)元中許多信號通路的匯聚點，p-CREB在海馬新生未成熟神經(jīng)元中表達豐富，BDNF/TrkB通路的激活可導致p-CREB蛋白的增加，后者在海馬神經(jīng)再生的關(guān)鍵步驟中起重要作用[17]。近期有研究[18-19]表明，Tau蛋白的活化及Aβ含量的增加會分別抑制BDNF的表達和BDNF在海馬神經(jīng)元中的膜泡運輸。該研究結(jié)果提示，遠志提取物可能通過激活BDNF/TrkB信號通路進而促進了小鼠海馬神經(jīng)的再生，從而提高了小鼠的學習記憶能力。

綜上所述，遠志提取物可改善AD小鼠學習記憶能力，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)BDNF/TrkB信號通路及減少Aβ沉積實現(xiàn)的。但遠志提取物促進小鼠海馬中BDNF的表達是否誘導了海馬神經(jīng)再生和突觸重塑尚不可知，需進一步研究。

[1]BLENNOW K,DE LEON MJ,ZETTERBERG H.Alzheimer′s disease[J].Lancet,2006,368(9533):387

[2]HOU YJ,WANG Y,ZHAO J,et al.Smart soup,a traditional Chinese medicine formula,ameliorates amyloid pathology and related cognitive deficits[J].PloS one,2014,9(11):e111215

[3]ZHANG H,HAN T,ZHANG L,et al.Effects of tenuifolin extracted from radix polygalae on learning and memory: a behavioral and biochemical study on aged and amnesic mice[J].Phytomedicine,2008,15(8):587

[4]LIN Z,GU J,XIU J,et al.Traditional chinese medicine for senile dementia[J].Evid Based Complement Alternat Med,2012,2012:692621

[5]LI X,CUI J,YU Y,et al.Traditional Chinese nootropic medicine radix polygalae and its active constituent onjisaponin B reduce β-amyloid production and improve cognitive impairments[J].PLoS One,2016,11(3):e0151147

[6]ZHAO H,WANG ZC,WANG KF,et al.Aβ peptide secretion is reduced by Radix Polygalae-induced autophagy via activation of the AMPK/mTOR pathway[J].Mol Med Rep,2015,12(2):2771

[7]趙歡,陳曉宇,姬飛虹,等.遠志提取物清除β淀粉樣蛋白的途徑及其信號通路的研究[J].安徽醫(yī)科大學學報,2014,7(7):913

[8]MUCKE L.Neuroscience: Alzheimer′s disease[J].Nature,2009,461(7266):895

[10]SENGUPTA U,NILSON A,KAYED R.The role of amyloid-β oligomers in toxicity,propagation, and immunotherapy[J].EBioMedicine,2016,6:42

[11]SALLOWAY S,SPERLING R,FOX NC,et al.Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate Alzheimer′s disease[J].N Engl J Med,2014,370(4):322

[12]WANG YJ.Alzheimer disease: lessons from immunotherapy for Alzheimer disease[J].Nat Rev Neurol,2014,10(4):188

[13]姚允怡,孫黎,薛建紅,等.遠志醇提取物改善阿爾茨海默病小鼠病理學的研究[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2012,50(11):11

[14]LEE JK,JIN HK,ENDO S,et al.Intracerebral transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells reduces amyloid-beta deposition and rescues memory deficits in Alzheimer's disease mice by modulation of immune responses[J].Stem Cells,2010,28(2):329

[15]JHA NK,JHA SK,KUMAR D,et al.Impact of insulin degrading enzyme and neprilysin in Alzheimer′s disease biology: characterization of putative cognates for therapeutic applications[J].J Alzheimers Dis,2015,48(4):891

[16]LI J,LUO Y,ZHANG R,et al.Neuropeptide trefoil factor 3 reverses depressive-like behaviors by activation of BDNF-ERK-CREB signaling in olfactory bulbectomized rats[J].Int J Mol Sci,2015,16(12):28386

[17]WEI Z,LIAO J,QI F,et al.Evidence for the contribution of BDNF-TrkB signal strength in neurogenesis: an organotypic study[J].Neurosci Lett,2015,606:48

[18]ROSA E,MAHENDRAM S,KE YD,et al.Tau downregulates BDNF expression in animal and cellular models of Alzheimer′s disease[J].Neurobiol Aging, 2016,48:135

[19]SEIFERT B,ECKENSTALER R,R?NICKE R,et al.Amyloid-beta induced changes in vesicular transport of BDNF in hippocampal neurons[J].Neural Plast, 2016,2016:4145708

(2016-10-25收稿 責任編輯王 曼)

PENGFang1)，CUIYuanbo2),SONGWenying1)，ZHANGJiawei1)，LIUJunbao3),GUANFangxia4)

1)DepartmentofClinicalMedicine，ZhengzhouShuqingMedicalCollege，Zhengzhou450064 2)TranslationalMedicineCenter，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou450007

3)DepartmentofTraditionalChineseMedicine，thePeople′sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 4)SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

radix polygalae;Alzheimer′s disease;learning and memory ability;mouse

Aim: To investigate the effects of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease(AD) mice.Methods: A total of 28 6-month-old AD male mice were equally allocated into 4 groups(control group, group A, group B and group C). Mice in the above 4 groups took radix polygalae at the dose of 0(the same volume of solvent),50,100,200 mg/kg orally once a day for three months, respectively. Three months later, the learning and memory ability was detected by Morris water maze test; the contents of soluble and insoluble Aβ40and Aβ42, the activity of BACE1 and γ-secretase in the hippocampus were examined by ELISA; the mRNA expressions of NEP,IDE and MMP-9 were measured by quantitative real time PCR; the protein expressions of NEP, IDE, MMP-9, BDNF, TrkB, p-TrkB, CREB and p-CREB in the hippocampus were tested by Western blot. Results: Compared with the control group, the number of platforms crossing increased, and the escape latency was shortened in group C; the soluble and insoluble Aβ40and Aβ42contents in the hippocampus of group A,B,C decreased, the mRNA and protein expressions of NEP and IDE were significantly upregulated, and the expression of BDNF, p-TrkB and p-CREB proteins in the hippocampus increased(P<0.05); the changes of the indexes mentioned above of group C improved significantly than group A and B(P<0.05). While the activity of BACE1 and γ-secretase, and MMP-9, TrkB, CREB expressions in the hippocampus showed no significant differences among the 4 groups(P>0.05). Conclusion: Radix polygalae could improve the learning and memory ability of AD mice, and degradation of Aβ and regulating BDNF/TrkB signaling pathway might be the possible molecular mechanism.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.008

*河南省科技廳重大攻關(guān)項目 12210130200

R259