microRNA-509-3p對肝癌HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響*

程豪為，楊薈玉，楊君霞，孫愛民，陳宏濤，楊小昂，巴秋菊

鄭州大學醫藥科學研究院肝病研究室 鄭州 450052

microRNA-509-3p對肝癌HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響*

程豪為△，楊薈玉，楊君霞，孫愛民，陳宏濤，楊小昂，巴秋菊

鄭州大學醫藥科學研究院肝病研究室 鄭州 450052

△男，1962年6月生，本科，高級實驗師，研究方向：肝病，E-mail:aiminsunzz@163.com

肝癌；HepG2細胞；微小RNA-509-3p；XIAP；細胞侵襲；增殖

目的：探討微小RNA(miR)-509-3p對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響及其機制。 方法：選取60例肝癌患者癌組織及癌旁組織，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-509-3p的表達。培養HepG2細胞，分別轉染miR-509-3p類似物和miR-509-3p抑制劑或X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)siRNA，以不進行任何處理的細胞為空白對照，利用CCK-8試劑及Transwell小室分別檢測miR-509-3p表達對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響。結果：miR-509-3p在肝癌組織中的表達低于癌旁組織(P<0.001)。miR-509-3p類似物組細胞增殖能力和細胞侵襲數均低于空白對照組(P均<0.05)，miR-509-3p抑制劑組細胞侵襲數高于空白對照組(P<0.05)，miR-509-3p過表達可抑制XIAP的表達(P<0.05)。 結論：miR-509-3p表達對肝癌細胞的增殖和侵襲能力有抑制作用，其機制可能是miR-509-3p低表達促進XIAP上調從而促進肝癌細胞增殖、增加其侵襲能力。

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，病死率高居全球第4位[1-2]。在我國，早期肝癌的發現率約為20%，發現時常為肝癌晚期或者因轉移性肝癌而被發現[3]。目前，我國肝癌患者的治療方案是以手術切除為主，但適合手術的患者并不多，而且花費較高，預后差。微小RNA(microRNA, 簡稱miR)是長20～24 nt的單鏈非編碼RNA，研究[4]表明其主要參與轉錄后基因表達調控，包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲和轉移等。近年來，越來越多的研究[5-7]表明miR-509-3p作為腫瘤抑制因子在多種類型的腫瘤發生過程中起作用，包括腎細胞癌、乳腺癌、急性淋巴細胞白血病、肺癌和肝癌。目前對肝癌機制方面的研究[8]已有大量報道，但是miR-509-3p在肝癌發生發展中所起的作用及其機制并沒有文獻報道。該研究采用實時熒光定量PCR檢測肝癌組織中miR-509-3p的表達，分析其對肝細胞增殖和侵襲能力的影響；以人肝癌細胞株(HepG2)為研究對象，采用CCK-8 法檢測miR-509-3p對HepG2細胞增殖的影響，應用Transwell細胞體外侵襲實驗觀察miR-509-3p對HepG2細胞侵襲能力的影響，以探討miR-509-3p抗肝癌的可能機制。

1 材料與方法

1.1 標本及主要材料

1.1.1 組織標本 60例肝癌患者癌組織及癌旁組織均取自于2010年至2014年在鄭州大學第一附屬醫院手術切取的標本，患者臨床資料在醫院病案室查得，術前均未接受過放、化療治療。該研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準?；颊邔υ撗芯烤橥?。

1.1.2 主要材料 肝癌細胞系HepG2購自中國科學院上海細胞研究所。胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM培養基(北京索萊寶科技有限公司)，miR-509-3p類似物和miR-509-3p抑制劑(上海吉瑪公司)，脂質體 2000(美國Invitrogen公司)，Trizol試劑(大連寶生物公司)，miR探針(美國Applied Biosystems公司)，CCK-8(日本東仁化學公司)，Transwell小室(美國Corning公司)。

1.2 細胞培養 將HepG2細胞在37 ℃、體積分數5%CO2恒溫培養箱中培養，培養基為含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基。 根據轉染物不同將細胞分為Ⅰ：空白對照組、miR-509-3p類似物組、miR-509-3p抑制劑組；Ⅱ：空白對照組、X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)siRNA組。采用脂質體 2000將miR-509-3p類似物和miR-509-3p抑制劑分別轉染miR-509-3p類似物組和miR-509-3p抑制劑組細胞，48 h后消化收集細胞用于進一步分析。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測miR-509-3p的表達 根據操作說明書，采用Trizol試劑分離細胞和組織標本的總RNA。將miR-509-3p特異性引物經過逆轉錄之后以U6為內參通過miR探針法檢測miR-509-3p的表達水平。反應體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，dNTP混合物200 μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 μL，加雙蒸水至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，90 ℃ 5 s，64 ℃ 34 s，連續進行42個循環。每組均設3個復孔。用2-ΔΔCt法計算miR-509-3p的相對表達量。

1.4 細胞增殖情況的CCK-8法檢測 將細胞以每孔5 000個的密度接種到96孔板中，分別接種24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養箱中繼續孵育2 h，然后用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值，表示細胞的增殖能力。每組設3個復孔。

1.5 Transwell細胞侵襲實驗 培養HepG2細胞，分別轉染miR-509-3p類似物和miR-509-3p抑制劑，以不進行任何處理的細胞為空白對照，將基底膜基質原液置于4 ℃冰箱過夜融化，將基底膜基質原液和預冷的無血清DMEM 按照體積比1：3的比例配制侵襲小室的上室凝膠液，每孔50 μL包被侵襲小室的上室，放置37 ℃孵育箱孵育2 h使其成膠。Transwell小室上室每孔接種200 μL不含血清細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基500 μL。 將Transwell板置于培養箱中繼續培養24 h后用結晶紫染色，顯微鏡下觀察被染色細胞，取5個高倍視野并進行計數，結果取均值。實驗重復3次。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計學分析。miR-509-3p在肝癌和癌旁組織中表達情況的比較采用配對樣本的t檢驗；不同組間細胞侵襲數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或單因素方差分析和LSD-t檢驗；2組間細胞增殖能力的比較采用2×5析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 miR-509-3p在肝癌和癌旁組織中的表達情況結果表明，與癌旁組織(1.074±0.017)比較，肝癌組織中miR-509-3p的相對表達量(0.327±0.021)下調(t配對=214.158，P<0.001)。

2.2 miR-509-3p過表達對細胞增殖的影響 結果見表1。由表1可知，miR-509-3p上調可抑制HepG2細胞的增殖，差異有統計學意義。

表1 miR-509-3p對肝癌細胞增殖的影響

F組間=47.446，P<0.001；F時間=253.215，P<0.001；F交互=217.577，P<0.001。

2.3 miR-509-3p對細胞侵襲能力的抑制作用 與空白對照組相比，miR-509-3p過度表達后可以降低細胞的侵襲能力，給予miR-509-3p抑制劑處理后，細胞的侵襲能力增加(表2)。

2.4 XIAP對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響 結果顯示，XIAP基因沉默可以抑制細胞的增殖與遷移能力(表3)。

表2 miR-509-3p 對肝癌細胞侵襲能力的影響

F=103.145，P<0.001；組間兩兩比較，P均<0.05。

表3 XIAP 對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響

*:F組間=33.115，P<0.001；F時間=212.756，P<0.001；F交互=118.866，P<0.001。#:t=197.368，P<0.001。

3 討論

miR在各種生物學調節過程中發揮重要作用[9]，包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲和轉移等。miR509-3p在多種腫瘤細胞中作為抑癌基因存在，但是其在肝癌組織及細胞中的表達情況并未見報道。該研究發現，與正常組織相比，miR-509-3p在肝癌組織中表達下調。此外，作者還發現miR-509-3p過表達可以抑制肝癌細胞的增殖，抑制肝癌細胞遷移能力，miR-509-3p低表達可增加肝癌細胞遷移能力。這些證據表明miR-509-3p的低表達可能與肝癌的發生有關。

由于XIAP與癌細胞對凋亡的敏感性密切相關，因此是惡性腫瘤預后重要的生物標志物[10]。XIAP在大部分腫瘤組織中都呈高表達，XIAP表達增高提示腫瘤患者預后較差，生存率降低[11-12]。 該研究中作者發現，miR-509-3p和XIAP在細胞增殖和轉移中發揮相反的功能，提示XIAP可能成為肝細胞中miR-509-3p的功能性靶基因。因而XIAP可能是肝癌的一個潛在的分子靶點，二者聯合有望成為肝癌分子靶向治療的一個新的發展方向。

總之，該研究證實了與癌旁組織相比，miR-509-3p在肝癌組織中表達下調。XIAP是miR-509-3p調控的下游靶基因，而且miR-509-3p對XIAP起負調節作用。加之，miR-509-3p被認為是一個腫瘤抑制基因，在肝癌中可能通過調節靶基因XIAP來阻止細胞的增殖和浸潤，這為腫瘤的基因治療提供了新視角，同時為肝癌靶向治療的發展提供了基礎。

[1]ALLARD C,DESGAGNE V,PATENAUDE J,et al.Mendelian randomization supports causality between maternal hyperglycemia and epigenetic regulation of leptin gene in newborns[J].Epigenetics,2015,10(4):342

[2]ARNER P,SINHA I,THORELLA,et al.The epigenetic signature of subcutaneous fat cells is linked to altered expression of genes implicated in lipid metabolism in obese women[J].Clin Epigenetics,2015,7:93

[3]BAFFY G,BRUNT EM,CALDWELL SH.Hepatocellular carcinoma in non-alcoholic fatty liver disease: an emerging menace[J].J Hepatol,2012,56(6):1384

[4]BARTEL DP.MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J].Cell,2004,116(2):281

[5]SU ZM,CHEN DQ,ZHANG EP,et al.MicroRNA-509-3p inhibits cancer cell proliferation and migration by targeting the mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 oncogene in renal cell carcinoma[J].Mol Med Rep,2015,12(1):1535

[6]XING F,SHARMA S,LIU Y,et al.miR-509 suppresses brain metastasis of breast cancer cells by modulating RhoC and TNF-α[J].Oncogene,2015,34(37):4890

[7]WANG YE,CUI M,CAI XL,et al.The oncoprotein HBXIP up-regulates SCG3 through modulating E2F1 and miR-509-3p in hepatoma cells[J].Cancer Lett,2014,352(2):169

[8]GALUPPO R,MAYNARD E,SHAH M,et al.Synergistic inhibition of HCC and liver cancer stem cell proliferation by targeting RAS/RAF/MAPK and WNT/β-catenin pathways[J].Anticancer Res,2014,34(4):1709

[9]葉小娟,蔡慧,何斌,等.微小RNA-320a通過靶向FoxM1調控肝癌細胞遷移[J].蘭州大學學報(醫學版),2015,41(3):7

[10]FORNER A,REIG ME,DE LOPE CR,et al.Current strategy for staging and treatment: the BCLC update and future prospects[J].Semin Liver Dis,2010,30(1):61

[11]SHINTANI M,SANGAWA A,YAMAO N,et al.Smac/DIABLO expression in human gastrointestinal carcinoma:association with clinicopathological parameters and survivin expression[J].Oncol Lett,2014,8(6):2581

[12]MIZUTANI Y,NAKANISHI H,LI YN,et al.Overexpression of XIAP expression in renal cell carcinoma predicts a worse prognosis[J].Int J Oncol,2007,30(4):919

(2016-12-09收稿 責任編輯姜春霞)

Effects of microRNA-509-3p on proliferation and invasiveness of liver carcinoma HepG2 cells

CHENGHaowei,YANGHuiyu,YANGJunxia,SUNAimin,CHENHongtao,YANGXiao′ang,BAQiuju

DepartmentofLiverDisease,InstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

liver carcinoma;HepG2 cell;microRNA-509-3p;XIAP;cell invasion;proliferation

Aim: To explore the role of microRNA(miR)-509-3p in proliferation and invasion of liver carcinoma cells. Methods: A total of 60 cases of liver carcinoma tissue and 60 cases of paracancerous tissue were selected, and the miR-509-3p expression was detected by real-time PCR.HepG2 cells were cultured and transfected with miR-509-3p mimic, miR-509-3p inhibitor or XIAP siRNA, and cells without any treatment were the control group.The cell proliferation activity was detected by CCK-8, and cell invasion was detected by Transwell cell migration assay.Results: The expression of miR-509-3p in liver carcinoma tissue was significantly lower than that in paracancerous tissue(P<0.001).Compared with the control group, the cell proliferation rate and the number of migration cells in miR-509-3p mimic group were significant lower(P<0.05), while those in miR-509-3p inhibitor group were higher(P<0.05),and miR-509-3p overexpression contributed to the inhibition of XIAP expression(P<0.05).Conclusion: miR-509-3p plays an important role in the development and progression of liver carcinoma, and its downregulation of miR-509-3p may be closely associated with the high expression of XIAP.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.009

*河南省基礎與前沿項目 142300410326

R735.7