鹽酸米諾環素聯合梔子苷對NO誘導PC12細胞凋亡的影響*

蔡智慧,王 晉,吳 瓊,常全忠#

1)漯河醫學高等專科學校基礎部生理學教研室 河南漯河 462002 2)漯河醫學高等專科學校基礎部病理生理學教研室 河南漯河 462002

鹽酸米諾環素聯合梔子苷對NO誘導PC12細胞凋亡的影響*

蔡智慧1),王 晉1),吳 瓊2),常全忠1)#

1)漯河醫學高等專科學校基礎部生理學教研室 河南漯河 462002 2)漯河醫學高等專科學校基礎部病理生理學教研室 河南漯河 462002

#通信作者，男，1965年12月生，博士，教授，研究方向：中樞神經系統的損傷及修復，E-mail：cqzchang@sina.com

鹽酸米諾環素；梔子苷；PC12細胞；凋亡；Caspase-3；Bcl-2

目的：探討鹽酸米諾環素、梔子苷單獨及聯合應用對NO誘導PC12細胞凋亡的影響及其可能機制。方法：PC12細胞分為對照組、鹽酸米諾環素組、梔子苷組和鹽酸米諾環素+梔子苷組(聯合應用組)。4組均用終濃度為0.5 mmol/L的NO供體SIN-1誘導細胞凋亡，SIN-1干預前12 h鹽酸米諾環素組加入終濃度為0.1 mmol/L的鹽酸米諾環素，梔子苷組加入終濃度為0.25 mmol/L的梔子苷，聯合應用組加入同上濃度的鹽酸米諾環素和梔子苷，對照組不給藥。CCK-8法測定細胞存活率，Hoechest 33342熒光染色觀察細胞凋亡情況，流式細胞儀測定細胞凋亡率，Western blot測定凋亡相關蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達。結果：與對照組相比，單用鹽酸米諾環素或梔子苷均能提高NO誘導的PC12細胞存活率，降低細胞凋亡率，增加Bcl-2蛋白表達，減少Caspase-3蛋白表達(P均<0.05)；二者聯合應用對上述指標的影響具有協同效應(P<0.05)。結論：鹽酸米諾環素和梔子苷均能抑制PC12細胞凋亡，且二者聯合應用作用優于單獨應用，其機制可能與抑制Caspase-3依賴性凋亡信號通路有關。

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的神經系統退行性疾病，隨著全世界人口老齡化的加重，其發病率逐年增加，成為一個嚴重的社會問題。目前，AD的發病機制尚不完全清楚。研究[1]報道，在AD等神經退行性疾病的病理生理過程中，神經元凋亡引起的神經元缺失起了主要作用。因此，選擇和開發能有效拮抗神經元凋亡的靶點藥物具有重要意義。資料[2-4]顯示，鹽酸米諾環素具有一定的神經保護作用，而中藥梔子提取物梔子苷具有減輕腦水腫和減少炎性因子釋放的作用。該研究利用3-嗎啡斯德酮亞胺(3-morpholinosyndnomine，SIN-1)作為NO供體，誘導PC12細胞凋亡，觀察鹽酸米諾環素、梔子苷單獨及聯合應用對細胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響，為鹽酸米諾環素和梔子苷在AD等神經退行性疾病預防和治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 梔子苷、SIN-1、CCK-8試劑均購自Sigma公司，鹽酸米諾環素購自合肥博美生物科技有限責任公司，Bcl-2單克隆抗體、GAPDH抗體、Caspase-3多克隆抗體購自Abcam公司，Annexin V-FITC試劑盒購自羅氏公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司，BSA、Hoechest 33342、DMEM高糖培養基、IgG二抗、胰蛋白酶均購自Solarbio生物技術公司。

1.2 細胞培養與分組 低分化PC12細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。參考文獻[5]用含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養PC12細胞，置于體積分數5% CO2、37 ℃、飽和濕度下培養，細胞達80%融合時以2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代，接種于96孔板，分為4組：對照組(SIN-1誘導凋亡)、鹽酸米諾環素組(鹽酸米諾環素+SIN-1)、梔子苷組(梔子苷+SIN-1)和聯合應用組(鹽酸米諾環素+梔子苷+SIN-1)。終濃度為0.5 mmol/L的SIN-1直接加入培養基中誘導細胞凋亡，鹽酸米諾環素和梔子苷在SIN-1干預前12 h加入，終濃度分別為0.1 mmol/L和0.25 mmol/L，然后再共浴12 h。

1.3 CCK-8法測定細胞存活率 按照CCK-8試劑盒說明，參照文獻[6]，取上述各組細胞，每孔加10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，酶標儀450 nm波長下測定各孔OD值。細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%。每組設10個復孔，實驗重復3次。

1.4 Hoechest 33342染色觀察細胞凋亡 參照文獻[5]，取各組細胞，用0.01 mol/L PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，空氣干燥后Hoechest 33342(5 mg/L)避光染色15 min，PBS沖洗2次，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參照文獻[7]，取各組細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，500 r/min離心，用PBS清洗細胞，離心后收集細胞，用Binding buffer懸浮細胞，加入Annexin V-FITC混勻后再加入5 μL碘化丙啶室溫下避光反應15 min，檢測細胞凋亡率。激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。每組設10個復孔，實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測Bcl-2、Caspase-3蛋白表達參照方法[7]，把各組細胞用冰冷的0.1 mol/L PBS洗滌2次，加裂解液收集細胞，低溫離心，收取上清液測定蛋白濃度并用上樣緩沖液調整，煮沸10 min后加樣，SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉，加一抗(Bcl-2單克隆抗體按1：1 200稀釋，Caspase-3多克隆抗體按1：1 500稀釋，GAPDH抗體按1：1 500稀釋)，4 ℃過夜，加二抗(按1：5 000稀釋)，室溫反應2 h后ECL顯影。以GAPDH為內參，采用IPP 6.0圖像分析系統進行圖像灰度值分析，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0處理數據。對4組細胞存活率、凋亡率和Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達行2×2析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞存活率和凋亡率比較 見表1。由表1可知，鹽酸米諾環素、梔子苷均能提高細胞存活率，降低細胞凋亡率，且二者聯合有協同效應。

表1 4組細胞存活率和凋亡率比較 %

2.2 4組細胞Hoechest 33342染色結果比較 見圖1。結果顯示：對照組有大量細胞核呈強藍白色熒光；鹽酸米諾環素和梔子苷組較對照組強熒光細胞(凋亡細胞)明顯減少，聯合應用組較單一應用組強熒光細胞減少。

A：對照組； B：鹽酸米諾環素組；C：梔子苷組；D：聯合應用組；圖中箭頭所指為凋亡細胞。圖1 4組細胞Hoechest 33342染色結果(×200)

2.3 4組細胞Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平的比較 見圖2、表2。由表2可知，鹽酸米諾環素和梔子苷均可增加Bcl-2蛋白表達，降低Caspase-3蛋白表達，且二者聯合有協同效應。

A：對照組；B：鹽酸米諾環素組；C：梔子苷組；D：聯合應用組。圖2 各組細胞Caspase-3及Bcl-2蛋白的表達

表2 各組細胞Caspase-3及Bcl-2蛋白表達的比較

3 討論

凋亡指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡[8]。在AD等神經退行性疾病的發生、發展過程中，細胞凋亡發揮了主要的作用。NO作為體內重要的信使分子，已證實[9-10]其過量釋放可以介導腦缺血、神經損傷等病理過程進而誘導細胞凋亡。

鹽酸米諾環素是一種半合成的四環素類衍生物，是一種傳統的抗菌藥物[11]。研究[2-3]發現，鹽酸米諾環素具有神經保護作用和抗炎作用。梔子苷是中藥梔子的有效成分，也是臨床治療腦水腫和醒腦中藥清開靈的主要成分；資料[4]顯示，梔子苷具有抗炎、抗腫瘤和神經保護作用。該研究以大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤分化細胞株PC12細胞為研究對象，用NO供體SIN-1誘導細胞凋亡，觀察鹽酸米諾環素、梔子苷單獨及聯合用藥對細胞存活、凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響。結果顯示，鹽酸米諾環素和梔子苷皆能提高細胞存活率，降低細胞凋亡率，且二者聯用具有協同作用。

Caspase-3和Bcl-2是凋亡研究領域的熱點，其中，Bcl-2是重要的抗凋亡因子[12]，Caspase-3是凋亡蛋白酶級聯反應的最終通路，活化的Caspase-3切割下游相應的胞漿胞核底物導致細胞凋亡，從而發揮促凋亡作用[13]。當受到外界刺激時，體內抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白協同作用，共同決定細胞是否進入凋亡程序。該研究中Western blot檢測結果顯示：鹽酸米諾環素、梔子苷均能使抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，促凋亡蛋白Caspase-3表達減少，二者聯合應用對Caspase-3 和Bcl-2蛋白表達的影響具有協同作用。

綜上所述，鹽酸米諾環素、梔子苷單獨及聯合用藥皆能抑制NO誘導的PC12細胞凋亡，且中西藥聯合應用效果更佳，其作用機制可能與抑制Caspase-3依賴性凋亡信號通路有關。 該研究結果為鹽酸米諾環素和梔子苷在AD等神經退行性疾病預防和治療中的應用提供了實驗依據。

[1]CHENG XL,LI MK.Effect of topiramate on apoptosis-related protein expression of hippocampus in model rats with Alzheimers disease[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(6):761

[2]CHEN M,ONA VO,LI M,et al.Minocycline inhibits caspase-1 and caspase-3 expression and delays mortality in a transgenic mouse model of Huntington disease[J].Nat Med,2000,6(7):797

[3]HEO K,CHO YJ,CHO KJ,et al.Minocycline inhibits caspase-dependent and -independent cell death pathways and is neuroprotective against hippocampal damage after treatment with kainic acid in mice[J].Neurosci Lett,2006,398(3):195

[4]王磊,辛文鋒,張文生.梔子苷治療阿爾采末病及神經保護的分子機制研究進展[J].中國藥理學通報,2012,28(5):604

[5]吳瓊,張淑玲,李曦,等.沉默ClC-3氯通道基因對PC-12細胞凋亡的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2016,51(1):59

[6]ZHENG WX,WANG F,CAO XL,et al.Baicalin protects PC-12 cells from oxidative stress induced by hydrogen peroxide via anti-apoptotic effects[J].Brain Inj,2014,28(2):227

[7]任京力,林玲,王雁梅,等.氯通道阻斷劑DIDS對過氧化氫誘導PC12細胞凋亡的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,50(1):17

[8]OLECHOWSKA-JARZAB A,PTAK-BELOWSKA A,BRZ-OZOWSKI T.Terapeutic importance of apoptosis pathways in pancreatic cancer[J].Folia Med Cracov,2016,56(1):61

[9]KIM BC,KIM YS,LEE JW,et al.Protective effect of Coriolus versicolor cultivated in citrus extract against nitric oxide-induced apoptosis in human neuroblastoma SK-N-MC cells[J].Exp Neurobiol,2011,20(2):100

[10]WEIGERT A,BRüNE B.Nitric oxide, apoptosis and macrophage polarization during tumor progression[J].Nitric Oxide,2008,19(2):95

[11]FAN H,ZHENG Y,XU L,et al.Effects of minocycline on learning and memory of mice following ischemic-hypoxic cerebral injuries[J].Neural Regen Res,2012,7(2):114

[12]DELBRIDGE AR,GRABOW S,STRASSER A,et al.Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies[J].Nat Rev Cancer,2016,16(2):99

[13]CHEN H,YANG X,FENG ZB,et al.Prognostic value of Caspase-3 expression in cancers of digestive tract: a meta-analysis and systematic review[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10225

(2016-05-17收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of minocycline combined with geniposide on apoptosis of PC12 cells induced by nitric oxide

CAIZhihui1),WANGJin1),WUQiong2),CHANGQuanzhong1)

1)DepartmentofPhysiology，BasicMedicineFaculty,LuoheMedicalCollege,Luohe,Henan462002 2)DepartmentofPathophysiology,BasicMedicineFaculty，LuoheMedicalCollege,Luohe,Henan462002

minocycline；geniposide；PC12 cell；apoptosis；Caspase-3；Bcl-2

Aim: To investigate the effects of minocycline, geniposide alone or combined on the apoptosis of PC12 cells induced by nitric oxide and the possible mechanism. Methods: PC12 cells were divided into control group, minocycline group, geniposide group and the combined group. The four groups were all given 0.5 mmol/L SIN-1 to induce apoptosis, minocycline group was given 0.1 mmol/L minocycline 12 hours before the SIN-1 intervention, geniposide group was given 0.25 mmol/L geniposide, the combined group was given the 2 drugs, and control group was not given any drug.The cell survival was determined by CCK-8 method，the apoptosis was observed by Hoechest 33342 fluorescent staining，the apoptosis rate was measured by flow cytometry，the expressions of the apoptotic related proteins Caspase-3 and Bcl-2 were detected by Western blot. Results: Compared with control group, the cell viability improved, the apoptosis rate decreased, the expression of Bcl-2 upregulated, and that of Caspase-3 downregulated in minocycline group and geniposide group(P<0.05); minocycline and geniposide had synergistic effects on the above indicators(P<0.05). Conclusion: Minocycline and geniposide both can inhibit the apoptosis of PC12 cells,but the effect of the combined application is superior to the single application. The mechanism may be related to the inhibition of Caspase-3 dependent apoptosis signaling pathways.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.012

*河南省科技廳基礎與前沿技術研究基金資助項目 152300410014；河南省教育廳高等學校重點科研項目 16A180031；漯河醫學高等專科學校博士基金資助項目 2014DF001；漯河醫學高等專科學校校級研究項目 2016-S-LMC-9

R338.2