左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

穆立華，張麗華#，蔣友旭，李小威，朱英麗

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014 2)河南省人民醫(yī)院臨床藥理室 鄭州 450003

左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

穆立華1)，張麗華1)#，蔣友旭1)，李小威1)，朱英麗2)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450014 2)河南省人民醫(yī)院臨床藥理室 鄭州 450003

#通信作者，女，1964年3月生，碩士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：冠心病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:zlhxp@126.com

左西孟旦；LPS；心肌細(xì)胞；損傷；乳鼠

目的：探討左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：將原代培養(yǎng)的SD乳鼠的心肌細(xì)胞分為3組：對照組、模型組和左西孟旦干預(yù)組。模型組和左西孟旦干預(yù)組用10 mg/L的LPS處理6 h建模，其中左西孟旦干預(yù)組于造模前用終濃度為0.30 μmol/L的左西孟旦預(yù)處理24 h。全自動生化儀檢測3組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH、CK含量；ELISA檢測培養(yǎng)液TNF-α、IL-6含量；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-Caspase-3及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α和IL-6含量增加，細(xì)胞凋亡率升高，凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，左西孟旦干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α、IL-6含量減少，細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved-Caspase-3表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論：左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少炎癥因子釋放，抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

急性心力衰竭起病急，死亡率高，其中由感染性內(nèi)毒素血癥所致的心力衰竭由于合并感染，其預(yù)后往往更差。其感染因素50%以上源于革蘭陰性菌，而細(xì)胞壁外膜的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是其致病的主要成分[1]。LPS可釋放入血或直接作用于多種效應(yīng)細(xì)胞，引起心肌細(xì)胞損傷或直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心力衰竭[2]。目前心力衰竭的治療主要包括利尿、強(qiáng)心、擴(kuò)血管三個方面。然而，左西孟旦作為新型鈣離子增敏劑，為心力衰竭的治療提供了新的途徑，其除具有傳統(tǒng)的正性肌力、擴(kuò)張血管等作用外，近來研究[3]還證實其具有抗炎、抗氧化、抗心肌細(xì)胞凋亡等作用。該藥雖已在臨床應(yīng)用，但其基礎(chǔ)研究仍較少，對心力衰竭的保護(hù)機(jī)制仍不明確。該研究觀察了左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。試劑：左西孟旦注射液(圣諾生物制藥有限公司，成都)，LPS(Sigma公司，美國)，Ⅱ型膠原酶(Worthington公司，美國)，胰蛋白酶(Life Technologies公司，美國)，DMEM培養(yǎng)基(索萊寶科技有限公司，北京)，胎牛血清(四季青生物工程材料有限公司，杭州)，Caspase-3抗體、Bcl-2抗體(萬類生物科技有限公司，沈陽)，GAPDH抗體(賢至生物科技有限公司，杭州)，F(xiàn)ITC山羊抗兔IgG(三箭生物技術(shù)有限公司，天津)，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，杭州)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(凱基生物技術(shù)股份有限公司，江蘇)。儀器：超凈工作臺(凈化設(shè)備有限公司，蘇州)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(THZ-98A)(一恒科技有限公司，上海)，離心機(jī)(TDZ5-WS)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，湖南)，pH計(PHS-3C)(電科學(xué)儀器股份有限公司，上海)，二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司，美國)，激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡(尼康儀器有限公司，日本)，電子天平(佑科儀器儀表有限公司，上海)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與分組 乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[4]方法并加之改進(jìn)：乳鼠消毒后取出心臟置于緩沖液中，剪碎心室組織(約1 mm3)后加入5 mL 1 g/L的胰蛋白酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化8～10次，棄掉第1次消化后的上清液，之后的上清液吸入至含體積分?jǐn)?shù)10%血清DMEM培養(yǎng)基中，終止消化，200目的篩網(wǎng)過濾，800 r/min離心5 min，棄去上層液體，加入含體積分?jǐn)?shù)20%血清的DMEM培養(yǎng)基，最后于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2)培養(yǎng)1.5 h后將未貼壁的心肌細(xì)胞懸液吸出，計數(shù)后接種于培養(yǎng)板，并加入0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶核苷抑制成纖維細(xì)胞生長，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換液，之后每24 h換液1次，培養(yǎng)4 d后行α-action染色，鑒定是否為心肌細(xì)胞。鑒定后設(shè)空白對照組、模型組、左西孟旦干預(yù)組，每組8個復(fù)孔。左西孟旦干預(yù)組加入濃度為0.30 μmol/L(MTT預(yù)實驗篩選的最佳濃度)的左西孟旦預(yù)處理24 h，其余組繼續(xù)培養(yǎng)，之后模型組及左西孟旦干預(yù)組各加入10 mg/L的LPS處理6 h后檢測以下指標(biāo)。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α、IL-6測定 收集各組細(xì)胞，用全自動生化儀測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH及CK含量，ELISA法分別測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6含量，所有操作步驟均按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。實驗重復(fù)6次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入300 μL Binding buffer，立即上流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot測定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液裂解后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，各組取等量蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉2 h，先后結(jié)合一抗(GAPDH按1：1 000稀釋，Caspase-3和Bcl-2均按1：500稀釋)和二抗(按1：5 000稀釋)，最后行膠片曝光。以目的蛋白和內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較3組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α、IL-6含量和細(xì)胞凋亡率以及Cleaved-Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài)變化及鑒定 在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞剛接種時未貼壁，呈圓形或橢圓形，24 h后開始貼壁生長，形態(tài)為不規(guī)則梭形。48 h后出現(xiàn)自發(fā)性搏動。4～8 d細(xì)胞增殖較快，數(shù)目較多。見圖1。

2.2 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α、IL-6含量變化 與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷指標(biāo)LDH、CK，炎性指標(biāo)TNF-α、IL-6含量升高；與模型組比較，左西孟旦干預(yù)組以上指標(biāo)降低，見表1。

圖1 心肌細(xì)胞的α-action染色(×400)

表1 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK、TNF-α、IL-6測定結(jié)果比較(n=6)

*:組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率比較 與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3(Caspase-3活化形式)表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,與模型組比較，左西孟旦干預(yù)組Cleaved-Caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高；與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率升高；與模型組比較，左西孟旦干預(yù)組細(xì)胞凋亡率降低，結(jié)果見圖2、表2。

1：對照組；2：模型組；3：左西孟旦干預(yù)組。圖2 各組細(xì)胞Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表2 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及凋亡率比較(n=3)

*：組間兩兩比較，P均<0.05；△：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

3 討論

感染性內(nèi)毒素血癥相關(guān)心力衰竭是造成內(nèi)毒血癥患者死亡的主要原因之一[5]，考慮與多種因素造成的炎癥反應(yīng)有關(guān)[6-10]。研究[11]表明炎性因子尤其是TNF-α、IL-6在心力衰竭病理過程中起著重要作用。TNF-α是炎性因子中重要的一員，可通過細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，IL-6可導(dǎo)致左室心肌肥大進(jìn)而引起心室重構(gòu)[12]。炎性因子增多、心肌細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激加重這三者在心肌重塑的過程中起著重要作用，而心肌重塑又是促進(jìn)心力衰竭進(jìn)一步發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。該實驗結(jié)果顯示模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-6含量升高，證實LPS損傷可導(dǎo)致炎性因子增多引起心臟損傷，而左西孟旦干預(yù)組二者的水平降低，證實左西孟旦能減少心力衰竭時炎性因子TNF-α、IL-6的釋放，從而起到抗炎作用，最終改善心功能。

內(nèi)毒血癥心肌組織可產(chǎn)生大量的活性氧損害線粒體膜，引起Caspase-3活化，其活化后可切割變?yōu)镃leaved-Caspase-3，從而啟動凋亡程序，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞損傷時LDH及CK釋放增多。而Caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者，在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位[13]。該實驗結(jié)果顯示模型組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中心肌損傷指標(biāo)LDH、CK釋放增多，凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，證實LPS可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，引起心肌損傷，最終導(dǎo)致心力衰竭。而左西孟旦干預(yù)組心肌損傷指標(biāo)LDH、CK，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)升高，表明左西孟旦可能通過抑制凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少心肌細(xì)胞的凋亡，從而減輕心肌損傷達(dá)到改善心功能的目的。

綜上所述，左西孟旦對LPS誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少心肌細(xì)胞炎癥因子釋放，抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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(2016-09-22收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Protective effect of simdax on LPS-induced neonatal rat cardiomyocyte injury

MULihua1)，ZHANGLihua1)，JIANGYouxu1)，LIXiaowei1)，ZHUYingli2)

1)DepartmentofVasculocardiology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofClinicalPharmacology,HenanProvincialPeople'sHospital,Zhengzhou450003

simdax；LPS；cardiomyocyte；injury；neonatal rat

Aim: To investigate the protective effect of simdax on lipopolysaccharide(LPS)-induced neonatal rat cardiomyocyte injury.Methods: The neonatal rat cardiomyocytes were allocated into 3 groups: control group, LPS group and LPS+simdax group. The cells in LPS+simdax group were pretreated with simdax(0.30 μmol/L) for 24 h. The cells in LPS group and LPS+simdax group were incubated with LPS(10 mg/L) for 6 h. The contents of LDH and CK in the culture medium were tested by automatic biochemistry analyzer,and those of TNF-α and IL-6 were evaluated by ELISA; the apoptosis was determined by flow cytometry; the expressions of Cleaved-Caspase-3 and Bcl-2 were measured by Western blot.Results: Compared with control group,the contents of LDH, CK, TNF-α and IL-6 as well as the apoptosis rate in LPS group were elevated significantly; the expression of Cleaved-Caspase-3 was increased apparently while that of Bcl-2 was reduced significantly(P<0.05). However, compared with LPS group, the contents of LDK, CK, TNF-α and IL-6 and the apoptosis rate in LPS+simdax group were significantly decreased, the expression of Cleaved-Caspase-3 was reduced, and that of Bcl-2 was increased(P<0.05).Conclusion: Simdax may inhibit the LPS-induced neonatal rat cardiomyocyte injury via decreasing the production of proinflammatory cytokines, down-regulating the expression of Caspase-3 and up-regulating the expression of Bcl-2.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.013

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃普通項目 201602103

R542.2