DGCR8在先天性心臟病患者血液及心肌組織中的表達(dá)*

李保平，田 捧，李 莉，趙冠男，武海英，岳軍明，李 群，范太兵，任琛琛，郭玉琪

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)田納西大學(xué)健康科學(xué)中心病理醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 孟菲斯，田納西州，美國 38163 3)河南省人民醫(yī)院兒童心臟中心 鄭州 450003 4)河南省婦科腫瘤納米醫(yī)學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450003

DGCR8在先天性心臟病患者血液及心肌組織中的表達(dá)*

李保平1)，田 捧1)，李 莉1)，趙冠男2)，武海英3)，岳軍明2)，李 群1)，范太兵3)，任琛琛1)，郭玉琪1，4)#

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)田納西大學(xué)健康科學(xué)中心病理醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 孟菲斯，田納西州，美國 38163 3)河南省人民醫(yī)院兒童心臟中心 鄭州 450003 4)河南省婦科腫瘤納米醫(yī)學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450003

#通信作者，女，1964年1月生，博士，教授，研究方向：出生缺陷、卵巢癌，E-mail：yuqi-guo@163.com

迪喬治綜合征危象區(qū)基因 8；先天性心臟病；室間隔缺損；法洛四聯(lián)癥

目的：探討迪喬治綜合征危象區(qū)基因8(DGCR8)與先天性心臟病(CHD)發(fā)生的關(guān)系及臨床意義。方法：收集CHD患兒及健康兒童血液樣本各40份，采用qRT-PCR方法檢測DGCR8 mRNA的表達(dá)；收集室間隔缺損(VSD)患兒心肌組織25份，法洛四聯(lián)癥(TOF)患兒心肌組織16份，采用qRT-PCR和Western blot方法檢測DGCR8 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析間隔缺損患兒血液中DGCR8的表達(dá)水平與心臟間隔缺損大小的相關(guān)性。結(jié)果：與健康兒童相比，CHD患兒血液中DGCR8 mRNA的表達(dá)量降低(P=0.037)；與VSD患兒相比，TOF患兒心肌組織中DGCR8 mRNA和蛋白的表達(dá)量降低(P<0.05)；DGCR8與心臟間隔缺損無明顯相關(guān)性(rS=-0.022，P=0.917)。結(jié)論：DGCR8基因的缺失與CHD的發(fā)生有關(guān)，影響心臟的正常發(fā)育。

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是胎兒的心臟和大血管在胚胎發(fā)育時期因各種原因?qū)е掳l(fā)育缺陷或部分發(fā)育停頓所造成的心臟及(或)大血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)等的異常改變。CHD是導(dǎo)致新生兒、嬰兒致殘、致死的重要原因。目前CHD 發(fā)病率整體呈上升趨勢，發(fā)病率已上升至10‰～12‰[1]。據(jù)中國出生缺陷防治報(bào)告(2012)報(bào)道，2011年全國CHD發(fā)生率為2000年的3.56倍，城市為4.41倍，農(nóng)村為2.97倍，居我國出生缺陷首位。在CHD患兒中，約30%在妊娠期間胎死宮內(nèi)，40%～60%在新生兒期死亡，CHD成為影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問題。研究[2-3]表明，miRNA在心臟形態(tài)發(fā)生、心肌細(xì)胞生長及分化過程中發(fā)揮著極其重要的作用，與心血管疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，可成為今后臨床治療的靶點(diǎn)。迪喬治綜合征危象區(qū)基因 8(DGCR8)是參與miRNA合成與成熟的重要蛋白，其通過與Drosha相互作用和穩(wěn)定微處理器復(fù)合物來促進(jìn)Drosha的切割，調(diào)控miRNA的生成，進(jìn)而影響miRNA對基因的調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，DGCR8的異常表達(dá)可影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[5-6]，影響胚胎干細(xì)胞的分化，導(dǎo)致臟器發(fā)育異常[7]、性染色體異常[8]，損害機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[9]，引起迪格奧爾格綜合征(chromosome 22q11.2 deletion syndrome，22q11DS)表象等[10]，由此可見，DGCR8參與了人類多種疾病的發(fā)生。該研究通過對DGCR8與CHD的發(fā)生關(guān)系進(jìn)行研究，以期為CHD的產(chǎn)前診斷提供新的篩查指標(biāo)，為臨床決策提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015 年7月至2016年7月就診于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院的40例CHD患兒[包括室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)16例，房間隔缺損5例，房間隔合并室間隔缺損9例，房室間隔缺損2例，法洛四聯(lián)癥4例，動脈導(dǎo)管未閉4例]和40例健康兒童靜脈血液(每例2 mL)，置于EDTA抗凝管中，30 min內(nèi)分離出單個核細(xì)胞，放入-80 ℃冰箱備用。用凍存管收集上述兩家醫(yī)院心臟外科手術(shù)治療的CHD患兒術(shù)中修剪下來的心肌組織41份，立即放入液氮罐中，并及時轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫渲蠽SD患兒心肌組織25份，法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)患兒心肌組織16份。所有CHD患兒均經(jīng)彩色多普勒超聲心動圖、心電圖檢查確定診斷，并經(jīng)外科手術(shù)證實(shí)診斷。該研究組別的性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院倫理評審委員會批準(zhǔn)，且均在患兒家屬知情同意的情況下取得標(biāo)本。

1.2 主要試劑和儀器 紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)，Quant Script RT試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)(上海天根科技有限公司)，DGCR8引物、GAPDH引物(上海生工生物科技有限公司)，兔抗DGCR8抗體、兔抗GAPDH抗體(ABcam 公司)，Trizol總RNA提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.3 DGCR8 mRNA的檢測 采用qRT-PCR法。使用Trizol方法提取血液及組織總RNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性，采用A(260 nm)/A(280 nm)檢測提取的總RNA純度合格。嚴(yán)格按照Quant Script RT試劑盒說明書操作。將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將cDNA放入-20 ℃冰箱保存，以備后續(xù)qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算DGCR8 mRNA的表達(dá)水平。引物序列見表1。每個樣本均重復(fù)測定3次。

表1 qRT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

1.4 DGCR8蛋白的Western blot法檢測 稱取100 mg心肌組織，細(xì)胞裂解液裂解后用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿，BCA 法測定蛋白含量，取樣50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后切取目標(biāo)蛋白條帶，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液封閉1 h后加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜，洗滌后掃描圖像，用Image J軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參。每個樣本均重復(fù)測量3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較CHD患兒與健康兒童血液中DGCR8 mRNA表達(dá)的差異、不同類型CHD患兒心臟組織中DGCR8 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析CHD間隔缺損患兒血液中DGCR8的表達(dá)與間隔缺損大小的相關(guān)性。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CHD患兒與健康兒童血液中DGCR8 mRNA表達(dá)水平的比較 CHD患兒血液中DGCR8 mRNA的表達(dá)水平[1.010(0.327，2.647)]低于健康兒童[1.870(0.617，4.252)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.085，P=0.037)。

2.2 不同類型CHD患兒心臟組織中DGCR8 mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較 與VSD組患兒比較，TOF組患兒DGCR8 mRNA表達(dá)水平降低[1.280(1.037，1.640)vs0.960(0.630，1.610)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.000，P=0.046)；DRCG8蛋白的表達(dá)水平亦降低[0.039(0.005，1.200)vs0.004(0.001，0.023)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.145，P=0.034)，見圖1。

圖1 VSD和TOF患兒心肌組織中DGCR8蛋白的表達(dá)

2.3 間隔缺損患兒血液中DGCR8的表達(dá)水平與心臟間隔缺損大小的相關(guān)性 CHD患兒心臟間隔缺損大小為8.15(6.08，11.5)mm，DGCR8 mRNA相對表達(dá)量為1.61(0.64，8.6)兩者無明顯相關(guān)性(rS=-0.022，P=0.917)。

3 討論

CHD的病因多種多樣，有遺傳危險(xiǎn)因素、環(huán)境危險(xiǎn)因素、 遺傳-環(huán)境因素共同作用，隨著研究水平的提高，遺傳因素越來越受到研究者的重視。已有研究[11-14]表明，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因異常與CHD的發(fā)生密切相關(guān)，如GATA4、ZIC3、NKX2.5、TBX1等。

DGCR8是位于人類22號染色體q11.2區(qū)域的一個等位基因，是雙鏈miRNA結(jié)合蛋白，它與RNA酶Ⅲ Drosha相互作用，促進(jìn)miRNA的成熟。研究顯示miRNA可作用于特定蛋白介導(dǎo)CHD的發(fā)生，通過促進(jìn)心肌細(xì)胞異常增生參與心臟重構(gòu)過程[15-16]，還可調(diào)控通道蛋白表達(dá)促使神經(jīng)-顱面-心臟缺陷的發(fā)生[17]，是導(dǎo)致CHD-肺動脈高壓形成的重要診斷依據(jù)[18]。

目前單純性的針對DGCR8在CHD中的研究較少。Sellier等[10]研究發(fā)現(xiàn)，22q11DS CHD患者血液中DGCR8表達(dá)不足，DGCR8低表達(dá)可阻止神經(jīng)嵴細(xì)胞中相關(guān)miRNA的形成，導(dǎo)致心血管疾病和顱面部畸形，如VSD損、心室雙出口和主動脈弓缺陷。Chapnik等[7]發(fā)現(xiàn)DGCR8的缺失可導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生，如永存主動脈干、主動脈弓畸形及間隔缺損。 然而，Borgmann等[19]對157例單純性心臟缺陷患者和25例患有心臟缺陷的22q11DS患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單純性的心臟畸形與22q11微缺失并無必然聯(lián)系。該研究發(fā)現(xiàn)CHD患兒血液中DGCR8表達(dá)水平低于健康兒童，表明DGCR8與CHD的發(fā)生有關(guān)，DGCR8低表達(dá)阻礙了心臟、血管的發(fā)育。

Chen等[20]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠DGCR8基因后可能導(dǎo)致了血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，血管腔變大，管壁變薄，心臟變大，心臟腔室變大，室壁變薄，與臨床晚期心力衰竭癥狀相似，證實(shí)DGCR8對血管平滑肌細(xì)胞甚或整個機(jī)體的發(fā)育都發(fā)揮著重要的作用。Rao等[21]發(fā)現(xiàn)敲除心臟橫紋肌中DGCR8可誘導(dǎo)左心室重塑，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展。作者的研究結(jié)果顯示，TOF患兒心肌組織中DGCR8的表達(dá)低于VSD患兒，一方面提示DGCR8與CHD發(fā)生關(guān)系密切，另一方面提示DGCR8基因的表達(dá)越低導(dǎo)致的CHD類型越復(fù)雜，阻礙胎兒早期心臟正常結(jié)構(gòu)的形成。

間隔缺損的大小、缺損位置、肺動脈高壓等因素是評估CHD患兒手術(shù)的重要指標(biāo)，關(guān)系到手術(shù)的成敗、術(shù)后的恢復(fù)及最終的結(jié)局。該研究對DGCR8表達(dá)水平與間隔缺損大小的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)DGCR8表達(dá)水平與CHD患兒心臟間隔缺損大小無明顯相關(guān)性，表明雖然DGCR8參與了CHD的形成，但并不直接影響CHD患兒間隔缺失的大小。

總之，通過對DGCR8基因表達(dá)水平的臨床研究，了解DGCR8基因與CHD之間的關(guān)系，可提高對CHD胎兒的產(chǎn)前診斷，提高出生人口質(zhì)量，降低不能矯正的缺陷兒的出生。

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(2016-10-10收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Expression of DGCR8 in blood samples and myocardial tissue from children with congenital heart disease

LIBaoping1)，TIANPeng1)，LILi1)，ZHAOGuannan2)，WUHaiying3)，YUEJunming2)，LIQun1)，F(xiàn)ANTaibing3)，RENChenchen1)，GUOYuqi1,4)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofPathologyandLaboratoryMedicine,UniversityofTennesseeHealthScienceCenterMemphis,TN,USA38163 3)PediatricHeartCenter,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 4)InternationalJointLaboratoryforGynecologicalOncologyNanomedicineofHenanProvince,Zhengzhou450003

DGCR8；congenital heart disease；ventricular septal defect；tetralogy of Fallot

Aim: To explore the expression and clinical significance of DGCR8 in children with congenital heart disease(CHD). Methods: The blood samples of 40 children with CHD and 40 healthy children were collected,respectively.qRT-PCR method was used to detect the expression of DGCR8 mRNA. The expression of DGCR8 in myocardial tissue from 25 children with ventricular septal defect(VSD) and 16 children with tetralogy of Fallot(TOF) was detected by qRT-PCR and Western blot,and the correlation between DGCR8 and septal defect was analyzed.Results: Compared with healthy children, the expression of DGCR8 in blood from children with CHD was decreased(P=0.037).The expressions of DGCR8 mRNA and protein in myocardial tissue from those with TOF were lower compared with VSD(P<0.05).There was no significant correlation between DGCR8 and the septal defect (rS=-0.022,P=0.917).Conclusion: The deletion of DGCR8 gene is associated with the development of CHD and affects the normal development of the heart.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.014

*國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 81572574；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 16IRTSTHN018；鄭州大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目 DYCX053

R725.4