肝細胞癌組織中CD163的表達及其與血管、淋巴管生成的關系*

范奇超，范麗玲，楊劍鑫，林揚元，謝 群#

1)莆田學院臨床醫學院臨床醫學系 福建莆田 351100 2)莆田學院基礎醫學院人體解剖學與組胚學教研室 福建莆田 351100

肝細胞癌組織中CD163的表達及其與血管、淋巴管生成的關系*

范奇超1)，范麗玲1)，楊劍鑫1)，林揚元2)，謝 群2)#

1)莆田學院臨床醫學院臨床醫學系 福建莆田 351100 2)莆田學院基礎醫學院人體解剖學與組胚學教研室 福建莆田 351100

#通信作者，女，1974年5月生，博士，教授，研究方向：腫瘤分子機制，E-mail：xqptu@163.com

CD163蛋白；CD34；D2-40；肝細胞癌；巨噬細胞

目的：探討CD163蛋白在原發性肝細胞癌(HCC)中的表達特點。方法：收集HCC及癌旁組織各50例，通過免疫組化法檢測HCC組織及癌旁組織中CD163、CD68蛋白的表達，利用CD34、D2-40標記血管、淋巴管生成情況，分析CD163、CD68蛋白的表達及其與病理學特征、血管和淋巴管生成等的關系。結果：癌組織中CD163蛋白的表達高于癌旁組織，CD68蛋白的表達低于癌旁組織(P均<0.001)；癌組織中CD163蛋白的表達在巨噬細胞占86.84%，13.16%表達在癌細胞；巨噬細胞中CD163蛋白的表達與肝硬化和Edmondson分級有關(P<0.05)；巨噬細胞中CD163蛋白高表達組的MVD及LMVD均高于低表達組(P均<0.001)。結論：CD163蛋白主要表達于巨噬細胞中，且與HCC的進展及血管和淋巴管生成有關。

在腫瘤的發生發展中，募集到癌變部位的巨噬細胞稱之為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAM)，是構成腫瘤微環境的重要成分，許多研究[1-3]指出TAM與胃癌、食管癌、直腸癌等多種腫瘤的血管、淋巴管的生成以及侵襲、轉移密切相關。CD163是一類相對分子質量為130 000的跨膜蛋白，主要表達在人類單核細胞和巨噬細胞。巨噬細胞在不同的腫瘤微環境中出現兩種不同的活化表型：經典活化型(M1型)和替代性活化型(M2型)。目前的研究[4]多用CD163標記M2型巨噬細胞，而認為CD68陽性表達的是泛巨噬細胞，且發現CD163和CD68陽性細胞在多種腫瘤組織中的浸潤明顯強于癌旁組織或正常組織，且浸潤程度與腫瘤的分化、預后緊密相關。然而，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中CD68和CD163蛋白的表達趨勢卻與其他腫瘤不盡相同，比如HCC組織中CD68蛋白的表達低于癌旁組織，而對于CD163蛋白表達的研究則出現一些不同的結果[5]。為了更加明確了解CD163蛋白在HCC組織中的表達情況及其作用機制，作者進行了如下研究。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 收集2011年3月至2013年8月在莆田學院附屬醫院經手術切除、常規福爾馬林固定、石蠟包埋并經病理確診的HCC癌組織標本50例，同時獲取相應的癌旁組織50例。其中男40例，女10例；年齡35～69歲，中位年齡48歲；腫瘤直徑1.5～13.0(5.2±2.2)cm；根據Edmondson分級：Ⅰ、Ⅱ級23例，Ⅲ、Ⅳ級27例。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體CD34(MAB-0034)、CD163(MAB-0206)、CD68(MAB-0041)、D2-40(MAB-0567)、即用型免疫組化染色試劑盒(KIT-9921)、SP超敏試劑盒(KIT-9710)及DAB試劑盒均為福州邁新生物技術開發有限公司產品。

1.3 CD34、CD163、CD68和D2-40蛋白表達的免疫組化檢測 CD34按照SP試劑盒說明進行染色，CD163、CD68和D2-40則按照HRP兩步法進行染色。石蠟標本進行常規切片、梯度乙醇脫水、脫蠟、檸檬酸高壓抗原修復、體積分數3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶及血清封閉后，滴加相應一抗，4 ℃孵育過夜，SP法滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫孵育，HRP兩步法則加入放大劑并滴加多聚酶結合物。所有切片均進行DAB顯色，蘇木精復染后中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察。

1.4 結果判斷 CD163、CD68染色結果判定：胞漿內若出現黃褐色或棕褐色顆粒即為陽性細胞。選取5個不重疊的視野，在高倍視野下進行觀察并計數，計算陽性細胞平均數。CD163蛋白陽性表達的細胞有兩種：一是陽性細胞呈紡錘形或星形，附著于癌組織的血竇內或癌旁組織肝血竇以及間質里的巨噬細胞；另有一部分陽性表達出現在肝癌細胞里；而CD68不論是在癌組織還是癌旁組織中，陽性表達的均為泛巨噬細胞。

D2-40、CD34 染色結果判定：CD34陽性表達為血管內皮細胞胞漿呈棕黃色顯色，D2-40陽性表達為淋巴內皮細胞胞漿呈棕黃色。CD34陽性判斷參照Weidner等[6]方法，先在低倍視野內初步篩選腫瘤組織內高血管密度區，然后在高倍視野下分別選擇5個高血管密度區計數微血管數目，最后求其平均值作為該患者的微血管密度(micro-vascular density，MVD)。D2-40陽性判斷參照Choi等[7]方法，先低倍鏡下尋找淋巴管密度高的區域，然后在高倍鏡下分別選擇4個高密度區計數淋巴管數目，取其平均數作為微淋巴管密度(lymphatic vessel density，LMVD)。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0進行分析，應用配對t檢驗比較HCC及癌旁組織中CD163和CD68蛋白表達的差異，應用兩獨立樣本的t檢驗比較不同臨床病理特征的HCC組織中CD163陽性表達的巨噬細胞、MVD和LMVD的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HCC及癌旁組織中CD163、CD68蛋白表達及MVD和LMVD的比較 見圖1。其中，癌組織中CD163陽性表達位于巨噬細胞的占86.84%，表達位于癌細胞的占13.16%。在癌組織中，CD68蛋白表達低于CD163蛋白(t=12.464，P<0.001)；在癌旁組織中，CD68蛋白表達高于CD163(t=7.043，P<0.001)。HCC癌組織和癌旁組織中MVD和LMVD的表達情況見表1。

表1 HCC及癌旁組織中CD163蛋白、CD68蛋白、MVD和LMVD的表達 個/高倍視野

2.2 不同病理學特征的HCC組織中CD163陽性表達的巨噬細胞、MVD和LMVD的比較 見表2。

2.3 不同級別CD163陽性表達巨噬細胞的HCC組織中MVD和LMVD的表達 巨噬細胞CD163陽性表達計數的中位值為37，據此中位值將50例HCC分成低表達組(26例)和高表達組(24例)。比較2組中MVD及LMVD的分布，結果見圖2、表3。

A：低表達組MVD； B：高表達組MVD；C：低表達組LMVD；D：高表達組LMVD。圖2 不同級別CD163陽性表達巨噬細胞的HCC組織中MVD和LMVD(SP，×400)

表3 不同級別CD163陽性表達巨噬細胞的HCC組織中MVD和LMVD的表達 個/高倍視野

3 討論

CD163是富含半胱氨酸清道夫受體超家族一員，主要表達在單核/巨噬細胞系。有學者[4]認為CD163是M2型巨噬細胞的表型標記物，而CD68是泛巨噬細胞的標記物。胃癌、食管癌等腫瘤組織中巨噬細胞CD68和CD163蛋白的表達均高于癌旁組織或非癌正常組織[8-9]。研究[10]表明HCC等腫瘤組織的CD68、CD163蛋白的表達出現異質性變化，并認為癌細胞與巨噬細胞之間的相互作用可能是導致這種現象的主要原因之一。

該研究發現HCC癌旁組織中CD68蛋白主要表達在血竇中，而HCC癌組織中CD68蛋白主要表達分布在癌巢周圍血竇，少量在間質組織中，且其表達低于癌旁組織，可能與HCC組織中血竇發生融合和破壞而導致CD68蛋白陽性細胞數少于癌旁組織有關，這與之前的同類報道[11]類似。進一步分析HCC癌組織中CD163蛋白的表達情況，結果顯示癌組織中CD163蛋白表達明顯高于癌旁組織；同時對比CD163和CD68蛋白的表達情況，發現在癌組織中，CD163蛋白表達明顯高于CD68，而癌旁組織中CD163蛋白表達卻低于CD68，這與之前的一些報道有些不同：Kong等[5]研究發現肝癌組織中CD163和CD68蛋白的表達均低于癌旁組織，且CD163蛋白表達無論在肝癌組織還是癌旁組織中均高于CD68的表達，從而認為CD163蛋白并不能很好地反映腫瘤的分化及預后。為了探究其中原因，作者對CD163蛋白表達所在的細胞及其形態與分布位置進行觀察分析，結果顯示癌巢中血竇和間質里分布著許多形態不規則染色較深的巨噬細胞，占到CD163蛋白表達總陽性率的86.84%，同時還發現在癌巢中的部分癌細胞也出現CD163蛋白的表達，甚至出現一些陽性細胞形態很大且極不規則，但可見異型性明顯的腫瘤細胞核，推測可能出現巨噬細胞與癌細胞的融合現象，這部分細胞占CD163蛋白總陽性率的13.16%，這可能就是癌組織中CD163蛋白表達高于CD68的重要原因之一。Shabo等[12-13]在腦膠質細胞瘤、結腸癌等組織中也發現CD163蛋白表達異常，提出了腫瘤細胞與巨噬細胞發生融合現象，腫瘤細胞表現為巨噬細胞抗原表型而出現CD163蛋白表達，且與腫瘤的分化、低生存期和腫瘤細胞增殖緊密相關。作者進一步探討巨噬細胞CD163蛋白表達與HCC病理學特征的關系，發現巨噬細胞CD163蛋白表達與HCC的肝硬化程度和分化關系密切，由于HCC的進展常常伴隨著肝炎-肝硬化-肝癌這一慢性進程，巨噬細胞可能參與HCC的發生發展，并對HCC侵襲程度具有一定的影響。

巨噬細胞是腫瘤微環境中重要的組成部分，其與腫瘤細胞之間的相互作用機制非常復雜，除了上述融合現象之外，還與腫瘤微血管、淋巴管形成密切相關[14]。該研究根據CD163蛋白在HCC巨噬細胞的表達中位值將HCC組織標本分為高表達組和低表達組，結果顯示CD163蛋白高表達組MVD和LMVD均高于低表達組，提示巨噬細胞CD163蛋白表達與HCC血管及淋巴管的生成密切相關，可能通過調控血管及淋巴管生成參與HCC的發生發展。但巨噬細胞CD163蛋白陽性表達與MVD及LMVD之間的相互作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，HCC組織中CD163蛋白主要表達于巨噬細胞中，且其表達參與HCC的進展及血管和淋巴管生成；HCC組織中還出現巨噬細胞與癌細胞融合現象。探討癌細胞與巨噬細胞融合現象、CD163等巨噬細胞表型標記物在癌細胞中的表達與腫瘤發生發展的關系將是后續有意義的嘗試。

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(2016-11-02收稿 責任編輯趙秋民)

Relationship of CD163 expression in hepatocellular carcinoma and the microvascular density and lymphatic vessel density

FANQichao1)，FANLiling1)，YANGJianxin1)，LINYangyuan2)，XIEQun2)

1)DepartmentofClinicalMedicine，ClinicalMedicalSchool，PutianUniversity，Putian,Fujian351100 2)DepartmentofAnatomy，HistologyandEmbryology，SchoolofBasicMedicalSciences，PutianUniversity，Putian,Fujian351100

CD163 protein；CD34；D2-40；hepatocellular carcinoma；macrophage

Aim: To investigate the expression of CD163 protein in hepatocellular carcinoma(HCC). Methods: The expressions of CD163 and CD68 in 50 cases of primary HCC and matched peritumoral tissues were assessed by immunohistochemistry. CD34 and D2-40 were used to determine microvascular density(MVD) and lymphatic vessel density(LMVD), respectively. The relationship among CD163 expression with clinicopathological parameters, angiogenesis and lymphangiogenesis was analyzed. Results: The expression of CD163 in HCC tissue was significantly higher than that in peritumoral tissue(P<0.001), whereas the expression of CD68 in HCC tissue was significantly lower than that in peritumoral tissue(P<0.001). The positive expression rates of CD163 in macrophages and hepatoma cells accounted for 86.84% and 13.16%, respectively. The expression of CD163 in macrophages was related with hepatic cirrhosis and Edmondson grades(P<0.05). MVD and LMVD in high CD163-expression macrophage group were significantly higher than those in low CD163 expression macrophage group(P<0.001).Conclusion: The high expression of CD163 in macrophages may result in HCC progression, angiogenesis and lymphangiogenesis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.016

*國家自然科學基金資助項目 81201670；福建省自然科學基金項目 2017J01546；莆田學院大學生創新創業訓練計劃 201511498007，201611498075，201611498008

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