三七總皂苷在兔牙齒移動過程中對牙周組織轉化生長因子-β1表達的影響*

楊 璐，王 冠，黎 婷#，孫晉虎

1)徐州醫科大學口腔醫學院 江蘇徐州 221004 2)徐州醫科大學附屬第二醫院口腔科 江蘇徐州 221006 3)徐州醫科大學附屬醫院口腔科 江蘇徐州 221004

三七總皂苷在兔牙齒移動過程中對牙周組織轉化生長因子-β1表達的影響*

楊 璐1,2)，王 冠1,2)，黎 婷1,2)#，孫晉虎1,3)

1)徐州醫科大學口腔醫學院 江蘇徐州 221004 2)徐州醫科大學附屬第二醫院口腔科 江蘇徐州 221006 3)徐州醫科大學附屬醫院口腔科 江蘇徐州 221004

#通信作者，女，1974年12月生，碩士，副主任醫師，研究方向：錯牙合畸形的矯治及機制研究，E-mail:2492767182@qq．com

三七總皂苷；兔；牙齒移動；牙周組織；轉化生長因子-β1

目的：觀察在牙齒移動過程中三七總皂苷(PNS)對兔牙周組織轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達的影響。方法：選用3～6月齡的雄性新西蘭兔16只，隨機分成PNS組和生理鹽水(NS)組，通過拉簧分別加力于下頜雙側第一前臼齒與門牙之間，建立兔牙齒移動模型，然后兩組分別肌內注射血栓通[10 mg/(kg·d)]和NS。建模前1周，建模后1、2、3、4周后分別采血，全自動生化分析儀檢測血清中鈣離子、磷離子以及堿性磷酸酶的含量。建模后第4周處死兔，取移動牙齒及其牙周組織，采用免疫組化染色和免疫熒光染色方法檢測TGF-β1的表達。結果：PNS組血清中堿性磷酸酶的含量高于NS組(P<0.05)，牙周組織中TGF-β1的表達高于NS組(P<0.05)。結論：在牙齒移動過程中，PNS能增加兔牙周組織中TGF-β1的表達，對牙槽骨的改建有一定的促進作用。

三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要化學成分，具有擴血管、抑制血小板凝聚、抗炎、抗氧化等藥理作用，臨床上廣泛應用于心腦血管和中樞神經系統疾病的治療[1]。近些年隨著對PNS的深入研究，學者們[2-6]發現其可以調節多種成體干細胞的分化，促進實驗動物骨髓基質干細胞向成骨細胞的增殖和分化。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)廣泛存在于正常組織細胞和轉化細胞中，可在骨形成和重建中誘導間充質細胞轉化，調節成骨細胞和破骨細胞的分化，促進細胞外基質的合成與分泌，從而協調間充質細胞、成骨細胞和破骨細胞的活動，調節骨組織修復重建，是骨吸收和骨形成過程的重要調節因子[7-9]。作者通過建立兔牙齒移動模型，觀察注射血栓通[3](純度約97%的PNS)對兔移動牙齒的牙周組織TGF-β1蛋白表達的影響，探討PNS對移動牙齒的牙周組織改建的作用機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 3～6月齡新西蘭兔由徐州醫科大學實驗動物中心提供(合格證編號：NO.201603253)。鎳鈦拉簧(北京圣瑪特科技有限公司)，牙用結扎絲0.20 mm，正畸測力計，牙科粘結劑，注射用血栓通(凍干)(250 mg/支，廣西梧州制藥集團股份有限公司)，TGF-β1抗體(北京博奧生物技術有限公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，驢抗兔二抗(SC-2095)(Stanta公司)，顯微鏡成像系統、正置顯微鏡(Olympus公司)，石蠟包埋機(Shadon Hispocentre公司)，RM2235型石蠟切片機(Leica公司)，Cobas 8000全自動生化分析儀(Roche公司)，Centrifuge 5702低速離心機(Eppendorf公司)

1.2 新西蘭兔實驗性牙齒移動模型的建立及分組處理 選用16只雄性新西蘭兔，均獨立籠養，自由進食，觀察1周后用于實驗。采用隨機數字表法分為PNS組和生理鹽水(NS)組2組，每組8只。PNS組按10 mg/(kg·d)肌內注射血栓通，NS組注射相應劑量生理鹽水，自正畸后第1天開始每d肌內注射用藥，直至處死前1 d。按30 mg/kg耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉進行全身麻醉后，將動物固定在兔臺上，拉開口角，顯露牙齒。凝膠酸蝕劑酸蝕牙齒顯露的軸面，用注射器沖洗，及時吸取沖洗液，謹防水誤入氣道導致兔死亡。隔濕，干燥，將鎳鈦拉簧分別固定于下頜左右第一前臼齒和門牙之間，并將兩個門牙結扎在一起，以下頜前牙為支抗拉下頜雙側第一前磨牙向近中移動(圖1)。將力控制在80 g，用牙用粘結劑固定結扎在牙齒上的結扎絲，去除多余粘結劑，待其室溫干燥粘固后，建模結束，實驗加力4周。術后注意動物保溫，待動物蘇醒后送回獨立籠內。密切觀察兔術后精神狀態、飲食量及體重的變化。正畸牙移動4周結束。

圖1 新西蘭兔實驗性牙齒移動模型的建立

1.3 血液標本采集及檢測 分別于建模前1周，建模后1、2、3、4周沿耳緣靜脈采集兔血，每只3～5 mL，裝入一次性真空采血管，注意避免溶血，室溫放置2 h使血清分離后，3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清，分裝，-80 ℃凍存備用。利用全自動生化分析儀分別測定血清中鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶的含量。

1.4 牙周組織標本制備 牙移動4周結束時用空氣栓塞法處死動物，將兔牙齒移動區骨組織連同移動的第一前臼齒一同取下，生理鹽水沖洗去除血液后，立即放于40 g/L多聚甲醛中固定一周。修正組織塊，經體積分數10% EDTA(pH=7.4)脫鈣5～6周，每隔1周更換脫鈣液。當針可以無阻力穿透骨組織時，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm近遠中方向切片備用。

1.5 牙周組織中TGF-β1蛋白表達的免疫組化檢測 取石蠟切片，脫蠟，復水，檸檬酸緩沖液微波加熱進行抗原修復，自然冷卻至室溫，按免疫組化試劑盒說明書進行，完成免疫染色步驟，顯微鏡觀察并拍照記錄。利用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0 計算牙周組織切片中陽性染色區域的平均光密度。

1.6 牙周組織中TGF-β1蛋白表達的免疫熒光檢測 取石蠟切片，水化，抗原修復，BSA+Triton封閉液封閉，37 ℃ 1 h，分別滴加一抗、熒光二抗，濕盒避光4 ℃孵育過夜。DAPI復染，甘油封片，熒光正置顯微鏡觀察拍照。利用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0 計算牙周組織切片中陽性染色區域的平均光密度。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0進行分析。應用重復測量數據的方差分析比較2組動物不同時間點血清中堿性磷酸酶、磷和鈣含量的差異，應用t檢驗和秩和檢驗分析2組動物牙周組織中TGF-β1蛋白表達的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組動物血清中堿性磷酸酶、磷和鈣含量的比較 見表1、2、3。

2.2 2組動物牙周組織中TGF-β1蛋白表達的比較 免疫組化檢測結果見圖1。TGF-β1在PNS組牙周組織中近牙周膜的牙槽骨區(即新骨形成區)陽性表達，在張力側的表達較壓力側強且分布范圍更廣。PNS組TGF-β1平均光密度值為(0.178±0.011),NS組TGF-β1為(0.151±0.002)，2組比較差異有統計學意義(t=2.220,P=0.038)。

表1 2組動物建模前、后血清中堿性磷酸酶含量比較 U/L

F組間=4.802，P=0.046；F時間=49.991，P<0.001；F交互=1.132，P=0.339。

表2 2組動物建模前、后血清中磷濃度比較 mmol/L

F組間=1.241，P=0.284；F時間=1.600，P=0.187；F交互=1.697，P=0.164。

表3 2組動物建模前、后血清中鈣濃度比較 mmol/L

F組間=2.961，P=0.107；F時間=11.190，P<0.001；F交互=1.141，P=0.347。

免疫熒光檢測結果見圖2。免疫熒光染色以牙周組織出現紅色熒光為陽性表達。TGF-β1在PNS組牙周組織中呈陽性表達，張力側的新骨形成區表達較壓力側明顯。TGF-β1在NS組牙周組織中幾

上：PNS組；下：NS組；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；D：牙齒；T：張力側；P：壓力側。圖1 2組動物近遠中牙周組織中TGF-β1蛋白表達的免疫組化檢測結果(PV,×100)

乎不表達，只在張力區有微弱表達。PNS組TGF-β1平均光密度值為66.333(62.928,67.047)，NS組為51.608(50.691,56.097)(Z=3.477,P=0.001)。

上：PNS組；下：NS組；AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；D：牙齒；T：張力側；P：壓力側。圖2 2組動物近遠中牙周組織中TGF-β1蛋白表達的免疫熒光檢測結果(×100)

3 討論

牙齒移動的過程也是牙周組織改建的過程，期間牙周骨組織(牙槽骨)的改建不容忽視。研究[10-12]證實,前列腺素E(PGE)、白介素1(IL-1)、骨形成發生蛋白2(BMP-2)、TGF-β1等都對骨改建有一定的促進作用。TGF-β1作為骨形成和骨吸收的重要調節因子，能趨化成骨細胞活性，已有利用外源性TGF-β1 來促進骨折愈合及骨缺損修復的報道[13]。該實驗結果表明：在牙齒移動過程中，PNS可促進牙周組織TGF-β1的表達。

堿性磷酸酶作為一組單酯酶，廣泛存在于人體組織和體液中，其中大部分由骨細胞產生，小部分來自肝[14]。已有研究[15]表明，血清中堿性磷酸酶含量與骨代謝活動密切相關，在骨折愈合、骨肉瘤、骨纖維異常增殖癥等骨代謝旺盛的條件下，血清堿性磷酸酶的水平較高，且堿性磷酸酶活性的增加也可以增強成骨細胞的活性。該實驗結果顯示：在牙齒移動過程中，PNS組血清堿性磷酸酶含量高于NS組，說明在PNS的作用下，移動牙齒的牙周組織中成骨細胞相對活躍，對牙周骨組織改建有一定的促進作用。建模后，2組血清堿性磷酸酶含量及血清鈣濃度均低于建模前，可能與加力后壓力側破骨細胞活躍有關，具體原因仍需進一步研究。

另有研究[16]表明TGF-β1可以使細胞的堿性磷酸酶活性升高，從而調節細胞分化，與該研究堿性磷酸酶和TGF-β1的變化趨勢基本一致。

由于正畸加力周期一般不短于3周，臨床復診周期以4周較為常用[17]，并根據已有實驗[18]，作者在該實驗中設定了4個加力時間。針對該實驗藥物用量，有研究[3-4,6]雖涉及細胞培養藥物用量,但是作用于動物牙周骨組織的適宜濃度尚無報道，該實驗結合臨床血栓通的使用劑量，參考《醫學機能實驗學》中的“人和動物間按千克體重折算劑量表”，即1.5 kg兔與60 kg人換算系數為3.30，初步確定實驗中PNS用量約為10 mg/(kg·d)。對于PNS促進牙槽骨改建的適宜濃度以及臨床運用的方法，仍需進一步研究。

綜上，該實驗表明，PNS在牙齒移動中，可能通過促進TGF-β1信號通路增強堿性磷酸酶的活性，增強成骨細胞活性，從而促進成骨反應，對牙周組織的改建起了一定的積極作用。

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(2016-10-10收稿 責任編輯趙秋民)

Influence of panax notoginseng saponins on expression of TGF-β1 in periodontal tissue of rabbits during teeth movement

YANGLu1，2),WANGGuan1，2),LITing1，2),SUNJinhu1，3)

1)SchoolofStomatology，XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221004 2)DepartmentofStomatology，theSecondAffiliatedHospital,XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221006 3)DepartmentofStomatology，theAffiliatedHospital，XuzhouMedicalUniversity，Xuzhou，Jiangsu221004

panax notoginseng saponins；rabbit; movement of teeth；periodontal tissue；TGF-β1

Aim: To investigate the effect of panax notoginseng saponins(PNS) on the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in periodontal tissue of rabbits during teeth movement. Methods: Sixteen 3-6-month-old male New Zealand rabbits were randomly allocated into two groups. The rabbits of PNS group were injected Xueshuantong and the rabbits of normal saline group were injected normal saline. Two tension springs with 80 g force were respectively applied between the first premolars and mandibular anterior teeth. After four weeks raising, the rabbits were sacrificed for the first premolars and periodontal tissues. Immunohistochemical staining and immunofluorescence staining were used to detect the expression of TGF-β1 in periodontal tissues of the teeth. At the day before modeling, and the 1st,2nd,3rd,and 4th week after modeling, blood samples were collected. The concentration of calciumion, phosphorus ion and alkaline phosphatase in serum was determined with automatic biochemical analyzer. Results: The concentration of alkaline phosphatase in serum in PNS group was higher than that in normal saline group(P<0.05). The expression of TGF-β1 of PNS group was stronger than normal saline group(P<0.05). Conclusion: Panax notoginseng saponins can promote the expression of TGF-β1 in the periodontal tissue of rabbits, and may play a certain role in promoting alveolar bone remodeling during teeth movement.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.019

*徐州市科技計劃項目 KC14SH089

R783.5