山楂降脂軟膠囊中4種黃酮含量的測定*

杜 娟，左非非，魏雙艷，徐曉陽，張瑋杰，陰兆靜，徐 霞

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

山楂降脂軟膠囊中4種黃酮含量的測定*

杜 娟，左非非，魏雙艷，徐曉陽，張瑋杰，陰兆靜，徐 霞#

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

#通信作者，女，1965年4月生，博士，教授，研究方向：藥物分析，E-mail：xuxia@zzu.edu.cn

山楂降脂軟膠囊；葛根素；木犀草素；槲皮素；兒茶素；液質聯用

目的：建立同時測定山楂降脂軟膠囊中4種主要黃酮葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素的超高效液相-串聯質譜法。方法：在超聲條件下用甲醇提取山楂降脂軟膠囊供試品。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱分離，以體積分數0.1%甲酸乙腈和體積分數0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，在負離子模式下采用多反應監測。結果：葛根素、木犀草素、槲皮素、兒茶素分別在0.03～8.10、0.04～8.27、0.02～4.45及0.01～3.11 mg/L的范圍內線性良好，R2均>0.992，4種黃酮的平均加樣回收率在93.6%～107.5%，相對標準偏差在1.62%～2.21%。結論：建立了適用于快速測定山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的液質聯用定量方法，該方法靈敏、準確、穩定，可用于山楂降脂軟膠囊的質量控制。

高脂血癥是誘發動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中的主要危險因素之一，如何有效預防和治療高脂血癥已成為當今熱點研究之一[1-2]。“藥食同療”作為一種受我國歷代醫藥學家倡導的疾病治療方案，當下受到越來越多人的推崇[3]。現代藥理研究[4-6]表明,山楂具有降血脂、降低膽固醇含量、抗脂質過氧化等多種藥理作用。山楂降脂軟膠囊因原料為天然藥物，制備工藝復雜、合理性不高，質量很難嚴格控制[7-9]。因此，將盡可能多的有效單體成分作為質量評價指標是確保山楂降脂軟膠囊有效、安全及質量可控的可行手段。山楂降脂軟膠囊中主要活性成分為黃酮類化合物，這類黃酮主要是以葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素為苷元的一系列化合物[10-12]。現多采用高效液相色譜法(HPLC)測定山楂提取物中黃酮的含量。然而由于靈敏度的局限性, HPLC僅適用于提取物的測定[13-15]，若應用于制劑中，需進一步增大取樣量或采取大量溶劑提取后再濃縮富集的方法進行前處理，可操作性不強。文獻[16-18]報道的制劑中HPLC測定方法均存在一定不足。該研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS)測定山楂降脂軟膠囊中葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素4種黃酮的含量，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 儀器：XEVO TQD三重四級桿串聯質譜儀、超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC)購自美國Waters公司)，質譜工作站(Masslynx 4.1)。藥品與試劑：山楂降脂軟膠囊(鄭州大學藥學院制備)，二次重蒸水(自制)，甲醇、乙腈(質譜級，J.T.Baker贈)，葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素對照品(中國藥品生物制品檢定所，純度>99.8%)。實驗動物：健康SPF級成年雄性SD大鼠，體重200～250 g，均購自河南省實驗動物中心，動物許可證號SCXK(豫) 2015-0004，動物房溫度控制在(22±2)℃，濕度控制在60%～80%。

1.2 山楂降脂軟膠囊中4種黃酮含量的測定

1.2.1 UPLC-MS/MS條件 色譜條件：液相色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為A和B；梯度洗脫程序見表1；流速為0.2 mL/min，柱溫為室溫，進樣量為5 μL。

表1 山楂降脂軟膠囊中4種黃酮液相梯度洗脫程序

A:體積分數0.1%甲酸乙腈溶液；B：體積分數0.1%甲酸水溶液。

質譜條件：所用儀器為Waters公司的XEVO-TQD，采用電噴霧離子(ESI)源，負離子模式；毛細管電壓1.00 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔氣N2流速30 L/h，脫溶劑氣流速1 000 L/h，碰撞電壓14 V，透鏡電壓2.5 V。采用多反應監測(MRM)模式對藥物離子濃度進行測定。山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的質譜分析參數如表2所示。

表2 4種黃酮化合物的質譜分析參數

1.2.2 山楂降脂軟膠囊供試品溶液的制備 精密稱取山楂降脂軟膠囊內容物 31.50 mg 于具塞三角瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱取質量。超聲提取 45 min，放至室溫，用甲醇補足減失重量，搖勻濾過，取濾液。濾渣同法操作兩次，合并濾液，揮干，殘渣用甲醇溶解并定容至 50 mL，搖勻，用 0.45 μm濾膜過濾，即得山楂降脂軟膠囊供試品溶液。按照“1.2.1”項下測定條件，采用超高效液相質譜聯用儀測定葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素的含量。

1.2.3 血漿樣品的處理 精密移取100 μL血漿樣品于1.5 mL的Ep管中，加入500 μL乙腈，渦旋混合3 min后，12 000 ×g離心10 min，取上清于另一潔凈的Ep管中，后置于真空濃縮儀中揮干樣品中的乙腈，殘留物中加入100 μL甲醇復溶，渦旋混勻2 min，12 000 ×g離心10 min，取上清液90 μL過0.22 μm微孔濾膜，上超高效液相質譜聯用儀進行分析。

1.3 方法學考察

1.3.1 線性范圍考察 取適量葛根素、木犀草素、兒茶素和槲皮素對照品，以甲醇進行梯度稀釋得一系列供試品溶液，精密移取5 μL置于100 μL的血漿樣品中，渦旋混勻，使得血漿樣品中葛根素質量濃度分別為33.3、100.0、300.0、900.0、2 700.0、8 100.0 μg/L，木犀草素質量濃度分別為34.0、102.2、306.5、919.7、2 759.3、 8 278.0 μg/L，槲皮素質量濃度分別為18.3、54.9、164.8、494.5、1 483.5、4 450.5 μg/L，兒茶素質量濃度分別為12.8、38.5、115.4、346.1、1 038.4、3 115.3 μg/L，按照“1.2.3”項下血漿樣品處理方法處理，在上述色譜和質譜條件下進行檢測，記錄色譜圖，以葛根素、木犀草素、槲皮素、兒茶素的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。

1.3.2 精密度試驗 取質量濃度分別為300、2 700 和8 100 μg/L(按葛根素的質量濃度)的山楂降脂軟膠囊血漿樣品進行日間和日內精密度考察。日內精密度，連續進樣6次；日間精密度，連續5 d采用同法測定，計算相對標準偏差(RSD)。

1.3.3 穩定性試驗 取質量濃度分別為300、2 700 和8 100 μg/L(按葛根素的質量濃度)的山楂降脂軟膠囊血漿樣品，每一濃度配制20個樣品，共配制3組樣品。將這3組樣品分別存放0、8、12和24 h，按照1.2.3項下方法，每個時間點處理5個樣品，在上述色譜和質譜條件進行檢測，考察樣品的穩定性。

1.3.4 加樣回收率試驗 取已測得4種黃酮含量的山楂降脂軟膠囊血漿樣品6份，分別精密加入相同體積的約等同于成藥樣品含量的4種黃酮化學對照品混合液，按照1.2.3項下方法處理樣品，在上述色譜和質譜條件進行檢測，計算樣品的加樣回收率。

2 結果

2.1 山楂降脂軟膠囊中黃酮含量測定 采用針泵進樣方式對質譜條件進行優化，在ESI負離子模式下進行全面掃描獲得最佳的化合物靈敏度。在優化條件下，4種黃酮成分峰分離較好，且響應及出峰時間穩定。山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的UPLC-MS/MS離子流圖見圖1。山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的含量由高到低依次為木犀草素、葛根素、槲皮素、兒茶素，分別為(1.86±0.10)%、(1.82±0.09)%、(1.00±0.05)%、(0.70±0.03)%。

從左至右：依次為葛根素、木犀草素、槲皮素、兒茶素。圖1 山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的離子流圖

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性范圍考察 線性回歸結果見表3。

2.2.2 精密度試驗 葛根素、木犀草素、槲皮素及兒茶素在不同質量濃度的山楂降脂軟膠囊血漿樣品中的日內精密度及日間精密度見表4。由表4可知，4種黃酮的日內和日間精密度均小于10.00%，表明該方法符合樣品檢測的方法學要求。

表3 4種黃酮的線性范圍考察結果

表4 山楂降脂軟膠囊血漿樣品中4種黃酮測定方法的精密度 %

2.2.3 穩定性試驗 結果顯示葛根素、木犀草素、槲皮素、兒茶素的RSD分別為：<1.81%、<1.95%、<1.27%、<1.71%(n=5)，表明樣品溶液在室溫條件下，24 h內穩定。

2.2.4 加樣回收率試驗 結果見表5。由表5可知，RSD<15.00%，符合生物樣品的測定要求。

表5 山楂降脂軟膠囊血漿樣品中4種黃酮的加樣回收率和RSD %

3 討論

葛根素、木犀草素、兒茶素及槲皮素是山楂降脂軟膠囊中4種主要的黃酮類成分，因此針對這4種黃酮化合物含量的監測對該軟膠囊的質量控制具有重要意義。該研究建立了同時測定山楂降脂軟膠囊中4種黃酮的定量方法，完善了山楂降脂軟膠囊的質量評價體系。研究結果顯示大鼠血漿中葛根素低、中、高3個濃度的相對回收率的RSD<15.00%，加樣回收率也符合生物樣品的測定要求。方法學評價結果表明，該方法穩定可靠，靈敏準確，短時間內即可完成一個樣品的測定，且樣品前處理簡單，可用于生產中山楂降脂軟膠囊的質量監控。

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(2016-12-14收稿 責任編輯徐春燕)

Simultaneous quantification of four flavonoids in hawthorn lipid-lowering soft capsules

DUJuan,ZUOFeifei,WEIShuangyan,XUXiaoyang,ZHANGWeijie,YINZhaojing,XUXia

CollegeofPharmaceuticalScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

hawthorn lipid-lowering soft capsule; puerarin; mignonette; quercetin; catechin; UPLC-MS/MS

Aim: To develop a quantitative method for simultaneous determination of puerarin, mignonette, quercetin and catechin in hawthorn lipid-lowering soft capsules using ultra performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry. Methods: Hawthorn lipid-lowering soft capsules were extracted with methanol under the condition of ultrasound. The separation was carried out on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) column. And the mobile phase was consisted of acetonitrile-0.1%(V/V) formic acid and H2O-0.1%(V/V) formic acid in a gradient elution mode. Then the sample solution was analyzed in electrospray ionization-ion mode with multiple reaction monitoring. Results: The results suggested that puerarin, mignonette, quercetin and catechin exhibited a good linearity in the range of 0.03～8.10，0.04～8.27，0.02～4.45 and 0.01～3.11 mg/L, respectively. And the correlation coefficient was higher than 0.992. The average recovery rate of the 4 flavonoids was in the range of 93.6%～107.5%, while the range of relative standard deviation was 1.62%～2.21%. Conclusion: The established method is sensitive, accurate and stable, and meet the requirement for determination of the 4 major flavonoids in hawthorn lipid-lowering soft capsules, thus could be used for quality control of hawthorn lipid-lowering soft capsules.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.020

R917

*河南省基礎與前沿技術基金資助項目 142300410085；鄭州市國際科技合作與交流項目 153PGJHZ204