巴戟天寡糖抗大鼠子宮缺血再灌注損傷作用的觀察

王志紅，程亮星，王武亮#，王 芳，徐 臻，王 冰，張海玲，耿 介，方 瑩

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院《腫瘤基礎(chǔ)與臨床》編輯部 鄭州 450052

巴戟天寡糖抗大鼠子宮缺血再灌注損傷作用的觀察

王志紅1)，程亮星2)，王武亮1)#，王 芳1)，徐 臻1)，王 冰1)，張海玲1)，耿 介1)，方 瑩1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院《腫瘤基礎(chǔ)與臨床》編輯部 鄭州 450052

#通信作者，男，1952年10月生，本科，主任醫(yī)師，教授，研究方向：婦科腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：wangwuliang888@sina.com

巴戟天寡糖；子宮缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；高能磷酸化合物；大鼠

目的：觀察巴戟天寡糖(MOO)對大鼠子宮缺血再灌注損傷的作用。方法：Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、子宮缺血再灌注損傷模型組以及3個(gè)MOO組[0.7、1.4、2.8 g/(kg·d)]，每組10只，采用線栓法制備大鼠子宮缺血再灌注損傷模型，造模前各組進(jìn)行相應(yīng)處理：假手術(shù)組和子宮缺血再灌注損傷模型組給予10 mL/kg雙蒸水，3個(gè)MOO組分別給予相應(yīng)濃度的藥液10 mL/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出大鼠子宮，并檢測組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及高能磷酸化合物(HEP)的水平。結(jié)果：與子宮缺血再灌注損傷模型組比較，MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組SOD水平升高，而MDA水平降低(P<0.05)；MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、總腺嘌呤核苷酸(TAN)水平升高(P<0.05)。3個(gè)MOO組SOD、MDA、ATP、ADP、AMP、TAN水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：MOO對子宮缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用，這可能與其能夠改善組織的抗氧化能力和能量代謝有關(guān)。

目前，缺血再灌注損傷的研究[1-2]多集中于心臟、腦、肝臟、腎臟等器官，而生殖系統(tǒng)器官缺血再灌注損傷的研究較少，但是缺血再灌注損傷對生殖系統(tǒng)造成的損傷也是非常嚴(yán)重的，在子宮腫瘤、卵巢腫瘤等疾病的治療過程中均可能發(fā)生缺血再灌注損傷，這一過程中出現(xiàn)的自由基過剩、能量代謝障礙、鈣超載、細(xì)胞凋亡等嚴(yán)重威脅著女性的生命健康安全。由子宮內(nèi)膜缺失、子宮畸形、子宮縱隔等導(dǎo)致的女性不孕是目前已有的輔助生殖技術(shù)所無法解決的，而子宮移植則可能為這類患者提供自身生育的可能，但是子宮移植仍然存在很多尚未解決的問題，這其中就包括子宮缺血再灌注損傷[2]。為了尋找解決這一問題的方案，該研究采用線栓法制備大鼠子宮缺血再灌注損傷模型，并用已經(jīng)被證實(shí)在多種器官的缺血再灌注損傷過程中具有保護(hù)作用的巴戟天寡糖(morinda officinalis oligose，MOO)在造模前進(jìn)行干預(yù)，以便觀察、分析子宮缺血再灌注損傷模型制備過程、發(fā)生機(jī)制及MOO對其的保護(hù)作用等。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、微量丙二醛(malondialdehyde，MDA)及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20150723、20150720、20150717；三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)及一磷酸腺苷(AMP)的鈉鹽均購自美國Amresco公司，批號分別為0220、0160、0634；MOO的提取由河南大學(xué)藥學(xué)院完成，具體方法參考文獻(xiàn)[3]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 721型分光光度計(jì)為上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；LC-6A型高效液相色譜儀、SPD-6A型紫外檢測器均為日本Shimadzu公司產(chǎn)品；Scienhome C18色譜柱(250 nm×4.6 nm, 5 μm)為江蘇淮安市恒天公貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法 50只健康雌性Wistar大鼠，體重為350～412(378±23) g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號為SCXK(豫)2010-0002。50只Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、子宮缺血再灌注損傷模型組、MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組5組，每組10只。3個(gè)MOO組按體重給予含相應(yīng)濃度MOO的10 mL/kg的藥液灌胃，假手術(shù)組和子宮缺血再灌注損傷模型組大鼠按體重給予10 mL/kg的雙蒸水灌胃，每天1次，連用7 d，末次給藥1 h后按照分組進(jìn)行處理。

1.3 大鼠子宮缺血再灌注損傷模型的制備 出假手術(shù)組外，各組大鼠末次給藥后1 h采用線栓法制備大鼠子宮缺血再灌注損傷模型[4]：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的戊巴比妥鈉(0.4 μL/g)腹腔注射麻醉，腹部正中切口，充分暴露子宮及周圍臟器，經(jīng)大隱靜脈注射50 U/kg肝素鈉后，鈍性分離腹主動(dòng)脈，在髂總動(dòng)脈分叉處上0.5 cm處結(jié)扎腹主動(dòng)脈，結(jié)扎30 min后，解除結(jié)扎線再灌注60 min，然后取出子宮并放置于-80 ℃冰箱中，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 子宮組織中SOD、MDA的檢測 每例子宮標(biāo)本稱取100 mg制成生理鹽水勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測組織總蛋白量。

1.5 子宮組織中高能磷酸化合物(high energy phosphates，HEP)的檢測 每例子宮標(biāo)本稱取100 mg，用預(yù)冷的0.42 mol/L高氯酸將子宮組織制成勻漿；并用1.00 mol/L氫氧化鉀進(jìn)行中和；超聲波細(xì)胞粉碎器粉碎線粒體膜，使能量物質(zhì)釋放于溶液中。4 ℃、15 000 r/min離心15 min；取上清液，用0.2 μm微孔濾膜過濾；吸取20 μL濾液上柱分析，色譜條件：流動(dòng)相由215 mmol/L KH2PO4與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%乙腈組成，三乙胺調(diào)pH值至6.1，流速為0.5 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃。經(jīng)過分析得出組織中所含ATP、ADP、AMP水平，并以ATP+ADP+AMP計(jì)算子宮總腺嘌呤核苷酸(total adenine nucleotides，TAN)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間SOD、MDA、ATP、ADP、AMP、TAN水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮組織生化指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組SOD水平降低，而MDA水平升高。與模型組比較，MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組SOD水平升高，而MDA水平降低。3個(gè)MOO組SOD、MDA水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠子宮組織生化指標(biāo)比較

*:與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與MOO 2.8 g/(kg·d)組比較，P<0.05；▲：與MOO 1.4 g/(kg·d)組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠子宮組織HEP水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組ATP、ADP、AMP、TAN水平降低。與子宮缺血再灌注損傷模型組比較，MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組ATP、ADP、AMP、TAN水平升高。3個(gè)MOO組ATP、ADP、AMP、TAN水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠子宮組織HEP水平比較 mg/g

*:與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與MOO 2.8 g/(kg·d)組比較，P<0.05；▲：與MOO 1.4 g/(kg·d)組比較，P<0.05。

3 討論

子宮缺血再灌注損傷常見于子宮外傷或子宮手術(shù)過程中，因其對子宮的危害較為嚴(yán)重，目前已成為婦產(chǎn)科學(xué)和病理生理學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。子宮缺血再灌注損傷的發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多機(jī)制共同作用的復(fù)雜病理生理學(xué)過程，目前研究[5]較多的方面是鈣超載、細(xì)胞凋亡、自由基過剩、免疫狀態(tài)異常等，關(guān)于能量代謝障礙在子宮缺血再灌注損傷過程中的作用尚未有研究報(bào)道。

MOO提取自中藥巴戟天，后者為茜草科植物，根可入藥，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)濕的作用，研究[6-8]證實(shí)，其在抗衰老、抗抑郁、抗凋亡、促進(jìn)血管生成等方面具有重要價(jià)值。汪寶軍等[3]研究證實(shí)，MOO有抗心肌缺血再灌注損傷作用,且這可能與其能夠提高心肌SOD等抗氧化酶活性及減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。但MOO在子宮缺血再灌注損傷中是否也具有相同的保護(hù)作用，尚未有報(bào)道。

子宮缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，黃嘌呤氧化酶激活、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)等使氧自由基生成增加，而且內(nèi)源性自由基清除酶類活性降低，機(jī)體清除氧自由基的能力降低，從而氧自由基開始攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸等，引起一系列的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成多種脂質(zhì)過氧化物，從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。SOD作為主要的細(xì)胞內(nèi)源性氧自由基清除劑，其水平能夠直接反映清除自由基的能力[9]。MDA是主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平能夠反映機(jī)體的脂質(zhì)過氧化程度，也可間接反映機(jī)體損害程度[10]。吉小微等[4]研究證實(shí)，子宮缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，子宮組織中的SOD水平下降，MDA水平上升，提示子宮缺血再灌注損傷的發(fā)生有機(jī)體氧自由基過剩導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化的參與。

有研究[11]認(rèn)為，能量代謝障礙是缺血再灌注損傷的始動(dòng)因子，ATP的生成和保存是保護(hù)器官組織結(jié)構(gòu)和功能完整的重要前提，而當(dāng)組織或器官缺血后，脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化受阻，該途徑的能量供應(yīng)減少，甚至中斷，僅靠糖的無氧酵解來提供ATP，后者提供ATP的量很少，且效率很低，這一現(xiàn)象將引發(fā)細(xì)胞代謝紊亂、功能異常以及組織結(jié)構(gòu)的破壞。由于ATP水平降低，不能提供組織所需能量時(shí)，機(jī)體將依次降解ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤以提供組織所需能量，這進(jìn)一步造成體內(nèi)ATP、ADP、AMP及TAN水平的降低。

該研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，子宮缺血再灌注損傷模型組SOD水平降低，而MDA水平升高，提示子宮缺血再灌注損傷后氧自由基的過剩以及抗氧化能力的降低。與子宮缺血再灌注損傷模型組比較，MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組SOD水平升高，而MDA水平降低，提示MOO能夠改善子宮缺血再灌注損傷組織的抗氧化能力。與假手術(shù)組比較，子宮缺血再灌注損傷模型組ATP、ADP、AMP、TAN水平降低，提示子宮缺血再灌注損傷發(fā)生后，子宮的能量代謝出現(xiàn)障礙。與子宮缺血再灌注損傷模型組比較，MOO 0.7 g/(kg·d)組、MOO 1.4 g/(kg·d)組、MOO 2.8 g/(kg·d)組ATP、ADP、AMP、TAN水平升高，提示MOO能夠改善子宮缺血再灌注損傷后的能量代謝障礙。3個(gè)MOO組SOD、MDA、ATP、ADP、AMP、TAN水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這種作用具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，MOO對子宮缺血再灌注損傷具有明顯保護(hù)作用，這可能與其能夠改善組織的抗氧化能力和能量代謝有關(guān)。

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(2016-09-13收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Protective effect of morinda officinalis oligose on uterine ischemia-reperfusion injury in rats

WANGZhihong1),CHENGLiangxing2),WANGWuliang1),WANGFang1),XUZhen1),WANGBing1),ZHANGHailing1),GENGJie1),FANGYing1)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)EditorialDepartmentofJournalofBasicandClinicalOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

morinda officinalis oligose;uterine ischemia-reperfusion injury;superoxide dismutase;malondialdehyde;high energy phosphate;rat

Aim: To investigate the protective effect of morinda officinalis oligose(MOO) on uterine ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: A total of fifty Wistar rats were randomly divided into 5 groups: the sham operation group, the uterine ischemia-reperfusion injury model group(model group), the MOO 0.7 g/(kg·d) group, the MOO 1.4 g/(kg·d) group, the MOO 2.8 g/(kg·d) group, and each group had 10 rats. The suture method was used to establish the uterine ischemia-reperfusion injury model. The rats in the sham operation group and the model group were given double steaming water at 10 mL/kg; the rats were given MOO solution accordingly at 10 mL/kg in the three MOO groups. Then the superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA) and high energy phosphates(HEP) in uterine tissue were determined. Results: Compared with the model group, the SOD level was increased significantly in the 3 MOO groups, and the MDA level was decreased significantly(P<0.05); the adenosine triphosphate(ATP), adenosine diphosphate(ADP), adenosine monophosphate(AMP) and total adenine nucleotides(TAN) levels were increased significantly in the 3 MOO groups(P<0.05). There were significant differences in the SOD, MDA, ATP, ADP, AMP and TAN levels between the three MOO groups(P<0.05). Conclusion: MOO could improve the antioxidation and energy metabolism of the ischemia-reperfusion injured uteruses, and protect the uterine tissue from ischemia-reperfusion injury.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.023

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