近紅外漫反射光譜法快速測定首烏丸中二苯乙烯苷的含量Δ

劉喜樂，賈燦潮，姬生國（廣東藥科大學中藥學院，廣州510006）

近紅外漫反射光譜法快速測定首烏丸中二苯乙烯苷的含量Δ

劉喜樂＊，賈燦潮，姬生國#（廣東藥科大學中藥學院，廣州510006）

目的：建立快速測定首烏丸中二苯乙烯苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測定首烏丸中二苯乙烯苷的含量（作為實測值）：色譜柱為ODS-C18，流動相為乙腈-水（25∶75，V/V），流速為0.8m L/m in，檢測波長為320 nm，柱溫為30℃，進樣量為10μL。采用偏最小二乘法-近紅外漫反射光譜法建立預測首烏丸中二苯乙烯苷含量的定量校正模型：根據實測值，采集校正集樣品76份、驗證集樣品18份，以標準歸一化法、一階導數法聯合濾波法預處理光譜，最佳波段為9 000～4 150 cm－1，主成分因子數為12。結果：首烏丸中二苯乙烯苷的含量測定方法學考察符合要求。二苯乙烯苷含量預測的定量校正模型內部交叉驗證決定系數為0.991 90，校正均方根偏差為0.020 1，預測均方根偏差為0.023 6，交叉驗證均方根偏差為0.076 29，預測值與實測值差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：該方法準確、穩定、簡便，可用于首烏丸中二苯乙烯苷含量的快速測定。

近紅外漫反射光譜法；首烏丸；二苯乙烯苷；含量；偏最小二乘法

首烏丸由制何首烏、熟地黃、桑椹等中藥組成，具有補肝腎、益精血、烏須發的功效，可用于治療肝腎兩虛、頭暈目花、耳鳴、腰酸肢麻、須發早白、高血脂等癥[1]。該制劑現收載于2015年版《中國藥典》（一部），采用高效液相色譜法（HPLC）作為測定首烏丸中二苯乙烯苷含量的標準方法，但該方法操作較為煩瑣，不僅費時費力，而且易破壞樣品[2]。近紅外漫反射光譜法（Near infrared diffuse reflectance spectroscopy，NIDRS）作為一門綠色分析技術，通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品中有機分子含氫基團的特征信息[3]，在藥物的定性、定量分析方面具有廣泛的應用前景[4-7]。鑒于此，本課題組采用NIDRS法建立了快速測定首烏丸中二苯乙烯苷含量的方法，以期為完善該制劑的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1120型全自動HPLC儀，配備SIL-20A自動進樣器、SPD-20A紫外檢測器、LC solution工作站（日本Shimadzu公司）；Nicolet6700型傅里葉變換近紅外光譜儀，配有漫反射積分球、樣品旋轉器和石英樣品杯、OMNIC光譜采集軟件和TQ 8.0分析軟件（美國Thermo公司）；BIY211b型萬分之一電子分析天平和AY120型十萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；M illi-Q AdvantageA10型超純水儀（美國M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑

首烏丸（廣東藥科大學中藥學院自制，編號：1～94，規格：10 g/丸）；二苯乙烯苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-14021907，純度：≥98%）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 NIDRS采集

取樣品適量，粉碎，過40目篩，取約4 g，混勻后置于石英杯中，輕輕振搖使其分布均勻，采用積分球漫反射系統，以空氣為參比，扣除背景采集NIDRS。采集條件：分辨率為8 cm－1，掃描范圍為12 000～4 000 cm－1，掃描累積次數為64次，溫度為（25±0.5）℃，相對濕度為28%～35%。94批樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖見圖1。

圖1 94批樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖Fig 1 Near in frared diffuse reflectance spectrum superposed graph of94 batchesof sam ples

2.2 二苯乙烯苷含量的測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗色譜柱：ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（25∶75，V/ V）；流速：0.8m L/m in；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數按二苯乙烯苷峰計≥2 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram s

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取二苯乙烯苷對照品4.03mg，置于10m L棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解，制成每1m L含二苯乙烯苷0.403mg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備取樣品粉末約0.4 g，精密稱定，置于25m L棕色量瓶中，加70%甲醇溶液25m L，稱定質量，加熱回流30min，放至室溫，再次稱定質量，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 方法學考察按相關標準進行方法學試驗，結果表明，精密度、穩定性、重復性試驗中二苯乙烯苷峰面積的RSD＜2.0%，表明儀器精密度、溶液穩定性、方法重復性均較好。

2.2.5 樣品含量測定取94批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表1。

表1 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 1 Results of content determ ination in sam p les（n＝3，%）

2.3 NIDRS定量校正模型的建立與驗證

2.3.1 校正集與驗證集樣品的選擇根據“2.2.5”項下二苯乙烯苷含量分布情況，從94批樣品中選取76批組成校正集，用于建立模型；其余18批樣品組成驗證集，用于驗證模型。選擇原則為驗證集樣品中二苯乙烯苷含量分布范圍應包含在校正集樣品二苯乙烯苷含量分布范圍之內，詳見表2。

2.3.2 光譜預處理方法的選擇分別以一階導數法（Firstderivative）、二階導數法（Second derivative）、濾波法（Savitizky-Golay filter，SG）、無濾過法（No smoothing）、標準歸一化法（SNV）、多元散射校正法（MSC）等方法預處理光譜或不進行預處理即常量光譜（Constant+Spectrum），得不同校正集內部交叉驗證決定系數（R2）、校正均方根偏差（RMSEC）和預測均方根偏差（RMSEP），結果見表3。

表2 校正集與驗證集樣品中二苯乙烯苷含量分布范圍Tab 2 Content distribution of calibration set and validation set for stilbene glycoside

表3 不同光譜預處理方法對定量校正模型性能的影響Tab 3 Effects of different pretreatm ent m ethods onthe property ofm odel

運用TQ 8.0分析軟件對表3數據進行處理，結合偏最小二乘法建立NIDRS定量校正模型。選擇R2、RMSEC、RMSEP為評價指標，綜合評價不同模型的準確性和適用性。其中，R2越接近1，NIDRS模型預測值與實測值相關性越好；RMSEC與RMSEP越接近，且RMSEC略小于RMSEP，所建模型適用性越強，預測效果越好。結果表明，以選取SNV+Firstderivative+SG預處理光譜效果最好，對光譜進行預處理，所建立的模型評價指標最好，可以用于建立穩健的模型。預處理后的紅外光譜圖見圖3。

圖3 預處理后的紅外光譜圖Fig 3 Infrared spectrum after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇建模波段區間要求包含樣品的大量信息，同時要避免冗余信息，降低噪聲干擾。交叉驗證均方根偏差（RMSECV）越小，所建模型適用性越強，預測效果越好。采用SNV+Firstderivative+SG對不同的波段進行手動優化，通過TQ 8.0分析軟件得到最佳波段范圍為9 000～4 150 cm－1，詳見表4。

表4 不同波段范圍對R2、RMSEC和RMSEP的影響Tab 4 Effects of different bands on R2，RMSEC and RMSEP

2.3.4 主成分數的選擇在建模過程中，采用不同的主成分數，模型的預測能力不同，若主成分數太少，建模信息不全，預測能力太低；反之，主成分數太多，驗證過程會出現過擬合現象。采用內部交互驗證考察主成分數對RMSECV的影響，并繪制曲線，詳見圖4。結果表明，當偏最小二乘法因子數為12時，RMSECV值最小為0.076 29，即最佳建模主成分數為12。

圖4 主分成分數對RMSECV的影響Fig 4 Effectsofmain com ponentson RM SECV

2.3.5 定量校正模型的建立運用TQ 8.0分析軟件，以76批樣品為校正集，18批樣品為驗證集，采用SNV+ Firstderivative+SG對光譜進行預處理，在4 150～9 000 cm－1波段范圍內，選擇12個主成分數進行。結果，用校正集樣品進行內部驗證，R2＝0.991 90，RMSEC＝0.020 1，RMSEP＝0.023 6，RMSECV＝0.076 29，二苯乙烯苷NIDRS實測值與預測值的相關圖和偏差圖見圖5。2.3.6定量校正模型的驗證選擇18批樣品作為驗證集進行外部驗證，將其NIDRS輸入定量校正模型，預測二苯乙烯苷含量，再與實測值進行比較，結果見表5。由表5可知，驗證集樣品的NIDRS預測值與實測值的絕對誤差為±0.05%，回收率為92.67%～107.88%，相對誤差為－1.88%～7.88%，說明所建模型具有良好的預測能力與適應性。將驗證集樣品含量實測值與NIDRS預測值進行配對t檢驗，t＝0.437 2，P＝2.110（＞0.05），按0.05的顯著性水平分析，實測值與預測值差異無統計學意義，說明該模型預測結果可靠。

圖5 首烏丸NIDRS預測值與實測值的相關圖和偏差圖Fig 5 Correlation plot and deviation plot for predicted value and m easured value of NIDRS of Shouwu pills

表5 17批驗證集樣品的NIDRS定量校正模型預測值與實測值比較（%）Tab 5 Comparison of predicted and measured value of quantitative calibration model for NIDRS of 17 batchesof validation set（%）

3 討論

本課題建立了可用于快速測定首烏丸中二苯乙烯苷含量的NIDRS定量分析模型，該模型參數R2為0.991 90，RMSEC為0.020 1，RMSEP為0.023 6，RMSECV為0.076 29，模型質量較好。經18批樣品進行驗證，模型預測結果準確，所建模型可用于快速測定首烏丸中二苯乙烯苷的含量，可為首烏丸生產加工或成品在線檢測提供理論參考。NIDRS分析技術作為快速無損的物理檢測技術，已成功應用于多種中藥指標成分的含量測定[8-12]，因其具有檢測速度快、準確性高、穩健性好等優點，在藥物生產加工以及成品在線檢測中優勢顯著。水分含量和二苯乙烯苷含量為評價首烏丸質量的兩大重要指標成分，本課題組前期已完成首烏丸中水分含量的近紅外光譜定量分析模型的建立[13]，結合本研究，可較為系統地評價首烏丸的質量。

綜上所述，本方法準確、穩定、簡便，可用于首烏丸中二苯乙烯苷含量的快速測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：1289-1290.

[2]徐廣通，袁洪福，陸婉珍.現代近紅外光譜技術及應用進展[J].光譜學與光譜分析，2000，20（2）：134-142.

[3]蔡麗芬，鐘國躍，張倩，等.不同產地與市場生何首烏和制何首烏的質量評價研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（2）：204-208.

[4]郭念欣，蔡佳良，姬生國.近紅外光譜技術在陳皮道地性分析中的應用[J].中國藥房，2013，24（15）：1394-1396.

[5]賈燦潮，盧慧娟，姬生國.NIRS快速測定制何首烏中的水分[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（16）：52-55.

[6]賈燦潮，盧慧娟，黃柳芳，等.何首烏中2，3，5，4′-二苯乙烯葡萄糖苷的NIRS法測定[J].中國醫藥工業雜志，2015，46（8）：833-836.

[7]賈燦潮，盧慧娟，趙紅寧，等.NIRS快速測定制何首烏中二苯乙烯苷的含量[J].計算機與應用化學，2015，32（7）：863-866.

[8]賈燦潮，盧慧娟，林丹，等.近紅外光譜技術快速測定何首烏中水分的含量[J].醫藥導報，2015，12（34）：1633-1636.

[9]賈燦潮，盧慧娟，劉喜樂，等.NIRS法快速測定制何首烏中醇溶性浸出物的含量[J].藥物分析雜志，2016，36（3）：554-558.

[10]陸婉診.現代近紅外光譜分析技術[M].北京：中國石化出版社，2006：31、145、174-193.

[11]姬生國，蔡佳良，鄭偉龍.近紅外光譜法測定霍膽丸中百秋李醇含量[J].中國藥學雜志，2013，48（24）：2154-2157.

[12]郭念欣，蔡佳良，李蕾蕾，等.運用近紅外技術建立蕾香正氣膠囊中厚樸酚的定量模型[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（8）：146-149.

[13]龔雪，賈燦潮，賴秀娣，等.近紅外光譜技術快速測定首烏丸水分含量[J].廣東藥科大學學報，2017，33（1）：61-64.

Rapid Determ ination of Stilbene Glycoside in Shouwu Pills by Near Infrared Diffuse Reflectance Spectrophotometry

LIU Xile，JIA Canchao，JIShengguo（Schoolof Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for the rapid determ ination of stilbene glycoside in Shouwu pills.METHODS：HPLC method was used to determ ine the content of stilbene glycoside in Shouwu pills（asmeasured value）.The determination was performed on ODS-C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（25∶75，V/V）at the flow rate of 0.8 m L/min. The detection wavelength was set at 320 nm，and the column temperature was 30℃.The sample size was 10μL.The partial least square method-near infrared diffuse reflectance spectrophotometry was used to establish quantitative calibration model for predicting the content of stilbene glycoside in Shouwu pills.According to measured value，76 calibration set samplesand 24 validation set samples were collected.Standard normalization method and first-order derivative method combined w ith Savitzky-Goly filter method were used for spectrum pretreatment.The optimal band ranged 9 000-4 150 cm－1，and main component factor was 12.RESULTS：The content determ ination method of stilbene glycoside in Shouwu pillswas in line w ith the requirements.The correlation coefficients，the root-mean-square error of calibration，the root-mean-square error of predication and the root-mean-square error of cross-validation（RMSECV）of the quantitative calibration modelwere 0.991 90，0.020 1，0.023 6 and 0.076 29.There wasno statistical significance between predicted value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The method is accurate，stable and simple，and can be used for rapid determination of stilbene glycoside in Shouwu pills.

Near infrared diffuse reflectance spectrophotometry；Shouwu pills；Stilbene glycoside；Content；Partial least squaremethod

R917

A

1001-0408（2017）18-2539-04

2016-12-28

2017-04-12）

（編輯：劉柳）

廣東省科技計劃項目（No.2009B030801044）

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源與質量。E-mail：xila_1990@ 126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥資源、中藥質量標準及中藥新藥研究。E-mail：shengguo_ji@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.26