一測多評法同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分的含量Δ

孫玲，樊曉蘭，郭綺，張小蒙，陳磊（.江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇鹽城4005；.四川農業大學動物科技學院，成都630；3.重慶市醫療器械技術審評認證中心，重慶400）

一測多評法同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分的含量Δ

孫玲1＊，樊曉蘭2，郭綺3#，張小蒙1，陳磊1（1.江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇鹽城224005；2.四川農業大學動物科技學院，成都611130；3.重慶市醫療器械技術審評認證中心，重慶401120）

目的：建立同時測定山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以灰氈毛忍冬皂苷乙為內標，計算其對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的相對校正因子（RCF），通過RCF計算上述4種皂苷類成分的含量；以外標法測定的上述皂苷類成分含量作實測值，比較計算值與實測值的差異。結果：灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙檢測進樣量線性范圍分別為0.316～6.32μg（r＝0.997 3）、0.453～9.06μg（r＝0.998 2）、0.231～4.62μg（r＝0.999 6）、0.342～6.84μg（r＝0.998 4）、0.147～2.94μg（r＝0.996 1）；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率試驗的RSD分別為97.74%～104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%～103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%～103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%～104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%～102.92%（RSD＝1.39%，n＝6）。計算值與實測值差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于山銀花藥材中5種皂苷類成分含量的同時測定。

一測多評法；山銀花；外標法；相對校正因子；灰氈毛忍冬皂苷乙

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風熱的功效[1]，臨床上常用于治療熱毒血痢、風熱感冒等疾病。山銀花藥材中有效成分眾多，皂苷類成分是除綠原酸外對其藥效起關鍵作用的一類重要成分，其中主要為常春藤皂苷類，即灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲等。

一測多評法的可行性在茶葉、大黃、黃連、人參等藥材中得以驗證[2-4]，作為一個質量標準測量方法已從2010年版《中國藥典》開始被收錄。本研究采用一測多評法，根據灰氈毛忍冬皂苷乙與其他成分的相對校正因子（RCF），通過測定灰氈毛忍冬皂苷乙的含量來計算多個皂苷類成分的含量，實現多指標質量分析的目的，并與外標法測定結果進行比較，評價該技術的可行性，為山銀花藥材中有效成分含量測定的相關研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、Alltech 2000ES蒸發光散射檢測器、G1316A柱溫箱、Agilent Chem Station工作站（美國Agilent公司）；P680型HPLC儀，包括P680A四元梯度泵、SEDEX75蒸發光散射檢測器、TCC-100柱溫箱、Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；AL-204型電子分析天平、AE240型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

灰氈毛忍冬皂苷甲對照品（上海同田生物技術股份有限公司，批號：140360-201310）；灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（批號：136849-201402）、川續斷皂苷乙對照品（批號：133289-201405）均購自南京澤朗醫藥科技有限公司；灰氈毛忍冬次皂苷甲對照品（南京廣潤生物制品有限公司，批號：128730-201403）；灰氈毛忍冬次皂苷乙對照品（上海詩丹德生物技術有限公司，批號：136849-201403），以上對照品純度均＞98%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

山銀花藥材購自湖南隆回，經筆者鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 基本原理

在一定線性范圍內，成分的量（質量或質量濃度）與檢測器響應值成正比，f＝W/A（W表示質量濃度，A表示響應值）。在多指標質量評價時，以藥材中某一典型組分（有對照品供應者）為內標，建立該組分與其他組分之間的RCF，通過RCF計算其他組分的含量。

假設某樣品中含有i個組分，fi＝Wi/Ai（i＝1，2，…，k，…，m），式中Ai為組分響應值，Wi為組分質量濃度。選取其中一組分k為內參物，建立組分k與其他組分m之間的RCF：fkm＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可導出定量計算公式：Wm＝（Wk×Am）/（fkm×Ak）[5]。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5m in，15%→18%A；5～8m in，18%→25%A；8～15m in，25%→75%A）；流速：1.0m L/m in；柱溫：32℃；進樣量：15μL；蒸發光散射檢測器（ELSD）漂移管溫度：100℃；空氣體積流量：3.2 L/m in。在上述色譜條件下，各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液精密稱取待測成分對照品適量，分別置于25m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙質量濃度分別為0.316、0.453、0.231、0.342、0.147mg/m L的混合對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chrom atogram s

2.3.2 供試品溶液取藥材樣品，干燥，研磨（過4號篩），精密稱取粉末0.5 g，置于圓底燒瓶中，精密加50%甲醇溶液50m L，搖勻，稱定質量，加熱回流2 h，放冷；再次稱定質量，用50%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，置于50m L量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液1、4、8、12、16、20μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.34%、1.73%、0.95%、1.22%、1.93%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙峰面積的RSD分別為1.66%、1.37%、0.89%、1.41%、0.65%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置48 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果，灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙含量的平均值分別為0.072%、4.527%、1.021%、0.053%、0.038%，RSD分別為1.36%、0.72%、1.91%、1.84%、0.73%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品適量，共6份，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

2.9 RCF的計算

以灰氈毛忍冬皂苷乙為內標，按“2.1”項下公式計算，結合“2.4”項下系列混合對照品溶液所得峰面積數據，計算灰氈毛忍冬皂苷乙分別對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙的RCF，結果見表3。

2.10 一測多評法系統適用性考察

2.10.1 不同HPLC儀和色譜柱考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察不同HPLC儀（Agilent1200、Dionex P680）和不同色譜柱（Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、DiamonsilC18）對RCF的影響。結果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為1.18%、3.95%、2.89%、3.12%，表明不同HPLC儀和色譜柱對RCF無顯著影響。

表3 RCF計算結果Tab 3 Resultsof RCF

2.10.2 不同流速考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察0.8、1.1、1.3m L/m in的流速對RCF的影響。結果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.83%、1.45%、3.61%、2.91%，表明流速對RCF無顯著影響。

2.10.3 不同柱溫考察精密量取“2.3.1”項下混合對照品適量，分別考察25、30、35、40、45℃的柱溫對RCF的影響。結果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為2.17%、3.21%、2.61%、2.95%，表明柱溫對RCF無顯著影響。

2.10.4 不同進樣量考察分別精密量取“2.3.1”項下混合溶液4、8、10、12、14、16μL，考察不同進樣量對RCF的影響。結果，灰氈毛忍冬皂苷乙對灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷甲和灰氈毛忍冬次皂苷乙RCF的RSD分別為3.12%、2.57%、1.36%、2.74%，表明進樣量對RCF無顯著影響。

2.11 樣品含量測定

取藥材樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按“2.1”項下公式計算樣品含量；采用外標法對山銀花藥材中4種皂苷成分進行多成分同步含量測定，結果見表4（表中ESM為實測值，QAMS為計算值）。結果，兩種方法測得結果差異無統計學意義（P＞0.05），表明建立的RCF具有較好的可信度，一測多評法計算結果可靠。

3 討論

由于中藥材的成分較為復雜，很難做到整體質量評價體系的認證，所以對于中藥中多組分、多靶點的質量控制成為了近年研究熱點。隨著人們對中藥材中多組分含量控制的深入研究發現，其內部含量在一定程度內察不同HPLC儀、不同色譜柱、不同柱溫和不同流速對RCF的影響，結果顯示以上因素對RCF無顯著影響。最后將計算值與實測值的結果進行了比較，結果表明，差異無統計學意義。因此在缺少對照品的情況下，可以利用RCF對山銀花藥材的皂苷類成分進行含量測定。

表4 樣品含量測定結果（n＝3，%）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：30.

[2]何兵，楊世艷，張燕.一測多評法中待測成分校正和定位的新方法研究[J].藥學學報，2012，47（12）：1653-1659.

[3]文乾映，龍芳，楊華，等.中藥質量控制中一測多評法的應用進展[J].中國藥房，2014，25（23）：2185-2187.

[4]Hou JJ，WuWY，Liang J，etal.A single，multi-faceted，en-hanced strategy to quantify the chromatographically diverse con-stituents in the roots of Euphorbia kansui[J].J Pharm Biomed Anal，2014，88（4）：321-328.

[5]Hou JJ，WuWY，Da J，etal.Ruggedness and robustness of conversion factors inmethod of simultaneous determination ofmulti-componentsw ith single reference standard [J].JChroma TogrA，2011，1218（33）：5618-5627.

[6]陸兔林，李金慈，于江泳，等.中藥標準物質在中藥飲片質量控制中的應用[J].中國中藥雜志，2014，39（1）：149-152.

Simultaneous Determ ination of 5 Saponins in Lonicerae Flosby QAMSM ethod

SUN Ling1，FAN Xiaolan2，GUO Qi3，ZHANG Xiaomeng1，CHEN Lei1（1.College of Pharmacy，Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu Yancheng 224005，China；2.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chongqing Accreditation Center for M edical Device and Technology，Chongqing 401120，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determ ination of 5 saponins in Lonicerae Flos.METHODS：Usingmacranthoidin B asa reference，HPLC method wasadopted to calculate the relative correction factor（RCF）of it to macranthoidin A，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B.The contentsof above 4 saponinswere calculated through RCF.Using the contents of saponins determ ined by external standard method as measured value，the calculated value was compared w ith measured value.RESULTS：The linear ranges ofmacranthoidin A，macranthoidin B，dipsacoside B，macranthoside A and macranthoside B were 0.316-6.32μg（r＝0.997 3），0.453-9.06μg（r＝0.998 2），0.231-4.62μg（r＝0.999 6），0.342-6.84μg（r＝0.998 4）and 0.147-2.94μg（r＝0.996 1），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoverieswere 97.74%-104.51%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.70%-103.20%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.12%-103.61%（RSD＝2.45%，n＝6）、98.80%-104.70%（RSD＝2.32%，n＝6）、99.21%-102.92%（RSD＝1.39%，n＝6），respectively.There was no statistical significance between calculated value and measured value（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and reproducible.It can be used for the determination of saponins in Lonicerae Flos.

QAMS；Lonicerae Flos；External standard method；Relative correction factor；Macranthoidin B

R927

A

1001-0408（2017）18-2546-04

2016-09-06

2017-03-27）

（編輯：張靜）

江蘇高校品牌專業建設工程項目（No. PPZY 2015A097）；鹽城市醫學科技發展計劃項目（No.YK2016053）

＊講師，碩士。研究方向：中藥鑒定及中藥分析。E-mail：vivianlovesun@163.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：臨床藥學和醫療器械技術審批。E-mail：cqguoqi@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.28