彝藥露水草中β—蛻皮激素的提取工藝研究

郭菊玲++楊勇幫++趙玉梅

摘要：目的采用纖維素酶法及澄清工藝提取彝藥露水草中β-蛻皮激素。方法纖維素酶法：加入纖維素酶，從其影響因素pH值，酶加入量，酶解溫度及酶解時間入手，采用L9（34）的正交試驗設計，分析實驗結果得出最優提取工藝流程；澄清工藝：加入不同類型及不同比例的澄清劑。結果pH值45，酶加入量9 mg，酶解溫度40℃，酶解時間30 min；殼聚糖澄清劑及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳。結論該工藝提取過程簡單、高效、節約成本，為改進生產企業從露水草中提取β-蛻皮激素的提取工藝提供參考依據。

關鍵詞：β-蛻皮激素；提取；纖維素酶；澄清劑；峰面積；透光率；提取工藝

中圖分類號：R2842文獻標志碼：B文章編號：1007-2349（2017）07-0070-04

露水草（Cyanotis arachnoides CBClarke）又名珍珠露水草，雞冠參等，屬鴨跖草科藍耳草屬多年生草本植物，其根可以入藥，夏秋采集，洗凈，鮮用或曬干。露水草有祛風活絡，利濕消腫，退虛弱等功效。用于風濕性關節炎，腰腿痛，腎炎水腫，虛熱不退；外用治濕疹，腳癬，刀傷。隨著科學研究的進步，近年來對露水草有效成分的研究也越來越深入，露水草中含有的β-蛻皮激素被廣泛用于養殖、保健、化妝品、醫藥行業[1]。

蛻皮激素作用于人體有促進膠原蛋白合成、抗心律不齊、抗疲勞；促進細胞生長、刺激真皮細胞分裂，排除體內的膽固醇；降血脂，抑制血糖上升；通經活絡，除濕鎮痛，等生理活性。是天然的抗癌制劑。露水草蛻皮激素自1976年問世以來，已研制不定期片劑、針劑、膏劑。民間用于風濕性關節炎，治療不同癥狀的風濕及關節炎患者有較好療效，其有效成分20-羥基蛻皮甾酮經臨床研究證明具有直接降血糖作用，對II型糖尿病總有效率84%，對改善糖尿病患者“三多一少”癥狀尤為明顯。

在運動保健品方面，蛻皮激素具有顯著的通過增加氨基酸裝配成蛋白鏈，從而刺激肌肉細胞質中蛋白質合成的能力，而且該能力回溯至蛋白質生長的轉譯和遷移過程。蛻皮激素不僅有益于健康而且安全，其有助于穩定在皮質醇傷害時的細胞，使能量合成步驟正常化（ATP和肌氨酸）和改善肝功能從而使有機體能迅速地適應環境和壓力變化。其安全性很高，經超過50次的研究顯示蛻皮激素沒有副作用，沒有與荷爾蒙的相互作用，毒性水平也極低。當1998年ICN生化實驗室對其進行測試時，數據顯示蛻皮激素要顯示出毒性必須達到6400 mg/kg的超高劑量。而且，在包含測試睪固酮，皮質醇，胰島素，促皮質素，生長激素和黃體生成激素的內分泌測試中，沒有任何蛻皮激素對哺乳動物荷爾蒙系統作用的報道。

在蠶業養殖上，用于促使桑蠶齡期縮短，上簇整齊，促進吐絲結繭；蛻皮激素是水生甲殼類——蝦、蟹類生長發育、脫殼變態所必須的物質，是“脫殼素”的主要原料；該品適用于蝦、蟹等水產甲殼類及地憋蟲的人工養殖，添加該品后可使蝦、蟹順利脫殼，促進蝦、蟹類脫殼的一致性，有效避免個體間的互相殘殺，顯著提高養殖成活率和商品規格。

在化妝品上，一般使用的是經過特殊處理后的高純度的蛻皮激素也叫“蛻皮甾酮”，呈純白色結晶性粉末或無色的透明結晶體，成分單一，對皮膚無過敏反應，具有很強的滲透性，在液態狀態下能快速被皮膚吸收；能增強細胞新陳代謝及活化的有效物質，具有良好的去角質、去斑增白作用，對面部黃褐斑、外傷性黑斑、雀斑、黑色素沉著等有很好的修復功效，另對粉刺亦有明顯效果。

可見β-蛻皮激素藥用價值極高，成為科學研究的一個熱點，因此，從露水草中如何高效地提取β-蛻皮激素成為了研究的關鍵。

本實驗為了探索從露水草中提取β-蛻皮激素的最佳工藝流程，試圖采用纖維素酶法[2]及澄清工藝進行提取[3-6]。從影響酶解的因素：PH值、酶加入量、酶解時間及酶解溫度入手，通過實驗得出一個最優的提取工藝流程。

1材料和方法

11試驗材料及試劑露水草干粉，β-蛻皮激素（北京壇墨質檢科技有限公司 北京北化恒信生物技術有限公司20140722），纖維素酶（國藥集團化學試劑有限公司20150107 酶活力/（U/g>150000）），ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A組分（北京正天成澄清技術有限公司），ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑B組分（北京正天成澄清技術有限公司），殼聚糖，冰醋酸，醋酸鈉，氫氧化鈉試液，70%乙醇，純化水，乙腈。

12儀器與設備電子天平（賽多利斯BSA224S-CW），電子天平（賽多利斯BP211D-OCE），三合一電極酸度計（ORION 3 STAR Thermo ELECTRON CORPORATION），超聲波清洗儀（CPXS800H-C 心能信超聲上海有限公司），高效液相色譜儀（安捷倫1260DAD），高速臺式離心機（TGL-10B 上海安亭科學儀器廠），紫外可見分光光度計（安捷倫Cary60），流水式粉碎機（YE3-1 永歷制藥機械有限公司），水浴振蕩器（SZX-B金壇市大地自動化儀器廠），數顯恒溫水浴鍋（XMTD 余姚市亞星儀器儀表有限公司）。

13纖維素酶法取露水草干粉各1 g，加入所設酶加入量，精密加所設pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，按所設溫度及所設浸漬時間處理樣品，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定，ZORBAX SB-C18柱（150mm×46 mm），流動相乙腈-水（17：83），柱溫30℃，流速10 mL/min，檢測波長240 nm。

14澄清工藝

141ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑的配制A組分溶液：稱取10 gA組分細粉，先用少量水溶解，充分攪拌成糊狀，再加水至100 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

B組分溶液：稱取10 gB組分細粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分攪拌成糊狀，再加1%醋酸溶液至100 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

142殼聚糖澄清劑的配制稱取10 g殼聚糖細粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分攪拌成糊狀，再加1%醋酸溶液至100 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

143試驗方法分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品作為空白對照，2號樣品加入A組分1 mL，3號樣品加入B組分1 mL，4號樣品加入殼聚糖1 mL，5-9號樣品依次按AB組分溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08 mL、06 mL、05 mL、04 mL、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02 mL、04 mL、05 mL、06 mL、08 mL，繼續振蕩15 h，過濾，采用紫外分光光度法測定。

2纖維素酶法影響因素分析及結論

21pH值的影響取露水草干粉各1 g，加入酶各6 mg，精密加25 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，pH值為35、40、45、50、55、60，48℃浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進行離心（3000r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定[1]。測定結果見表1、圖1。

結果分析：由A1：A2=C1：C2得出峰面積與濃度成正比，根據上圖趨勢可以看出，控制變量條件下pH=5為最佳酶解pH值。

22酶加入量的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為4，6，9，15，18，20 mg，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結果見表2、圖2。

結果分析：根據上圖趨勢可以看出，控制變量條件下18 mg為最佳酶加入量。

23酶解溫度的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為6 mg，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，分別設定溫度為20，30，40，50，60℃，浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結果見表2、圖3。

結果分析：根據上圖趨勢可以看出，控制變量條件下，50℃為最佳酶解溫度。

24酶解時間的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為6mg，精密加PH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，10 h，15 h，20 h，25 h，30 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結果見表4、圖4。

結果分析：根據上圖趨勢可以看出，控制變量條件下，05 h為最佳酶解時間。

25正交試驗當影響一個實驗的因素太多時，我們應該考慮利用正交試驗選擇一部分有代表性的點水平組合進行試驗，從而對諸多的影響因素進行綜合分析，以便于考慮各個因素之間的相互關系。正交試驗就是利用排列整齊的表——正交表來對試驗進行整體設計、綜合比較、統計分析，實現通過少數的實驗次數找到較好的生產條件，以達到最高生產工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的達到實驗的目的。

本實驗主要探究纖維素酶法提取露水草中β-蛻皮激素的四個參數：PH值（A），酶加入量（B），酶解溫度（C）及酶解時間（D）對提取率的影響。采用L9（34）的正交試驗設計，力求找到纖維素酶法提取β-蛻皮激素的最佳工藝流程。本次試驗采取β-蛻皮激素的峰面積為評價指標來選擇最佳提取條件。正交試驗結果見表5。

結果分析：從正交試驗極差分析可知，pH值，酶加入量，酶解溫度，酶解時間對β-蛻皮激素提取率的影響程度為：酶解溫度>酶解時間>pH值>酶加入量。最佳酶解條件為A1B3C2D1，即PH值為45，酶加入量為9 mg，酶解溫度為40℃，酶解時間為05 h。

3澄清劑的選擇

31高效液相色譜法測定分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品加入A組分1 mL，2號樣品加入B組分1 mL，3號樣品加入殼聚糖1 mL，4-8號樣品依次按A、B組分[7]溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08、06、05、04、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02、04、05、06、08 mL，繼續振蕩15 h，離心（3000 r 10 min）處理，精密量取各樣品上層清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%的乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結果見表6、圖5。

結果分析：通過比較使用不同組分澄清劑的各個樣品的峰面積，可以看出澄清劑的加入不影響其提取率。

32紫外可見分光光度法測定分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加PH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品作為空白對照，2號樣品加入A組分1 mL，3號樣品加入B組分1ml，4號樣品加入殼聚糖1 mL，5-9號樣品依次按AB組分溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08、06、05、04、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02、04、05、06、08 mL，繼續振蕩15 h，過濾，采用紫外分光光度法測定。測定結果見表7、圖6。

結果分析：根據圖表可以看出殼聚糖及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳，而靜置時間對其澄清效果影響不明顯。

4小結

采用纖維素酶法及澄清工藝提取彝藥露水草中β-蛻皮激素實驗中，通過L9（34）的正交試驗設計，分析實驗結果得出最優提取工藝流程：pH值45，酶加入量9 mg，酶解溫度40℃，酶解時間05 h。通過加入不同類型及不同比例的澄清劑，分析結果得出殼聚糖澄清劑及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳，而靜置時間對澄清效果影響不明顯。

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