生長素釋放肽對心力衰竭大鼠心肌細胞抗凋亡機制的初步研究

曹勁松，邢宇彤，劉俊琰，汪高磊，周剛，肖明第

基礎與實驗研究

生長素釋放肽對心力衰竭大鼠心肌細胞抗凋亡機制的初步研究

曹勁松，邢宇彤，劉俊琰，汪高磊，周剛，肖明第

目的：探討生長素釋放肽（GHRP）對心力衰竭（心衰）大鼠心肌細胞抗凋亡機制。

方法：40只雄性SD大鼠，隨機分為4組：正常對照組、假手術組、心衰模型組、GHRP治療組，每組10只。通過結扎冠狀動脈左前降支缺血誘導大鼠建立心衰模型。術后各組大鼠正常飼養4周，檢測心臟功能,觀察各組大鼠心肌細胞形態學改變。免疫蛋白印跡（Western blot）方法檢測各組心肌細胞Smac/DIABL0蛋白和B型白細胞/2型淋巴細胞樣蛋白（Bcl-2）表達情況。應用流式細胞（FCM）技術檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況。比較各組間各指標差異，探討GHRP對心衰大鼠心肌細胞抗凋亡機制。

結果：GHRP治療組大鼠的心臟擴張程度較心衰模型組輕，而左心室射血分數比心衰模型組高（P<0.05）。GHRP治療組的心肌細胞病理改變程度較心衰模型組輕（P<0.05）。GHRP治療組Smac/DIABLO表達水平較心衰模型組顯著降低（P<0.05），心衰模型組Bcl-2水平較其余三組明顯降低（P<0.05）。GHRP治療組Bcl-2表達水平較正常對照組明顯增高（P<0.05）。心衰模型組與GHRP治療組心肌細胞FCM凋亡指數比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

結論：GHRP具有抑制心肌細胞凋亡的抗心衰作用，其機制可能部分通過促進Bcl-2抗凋亡蛋白表達，抑制由Smac/DIABLO介導的線粒體途徑的心肌細胞凋亡實現。

心力衰竭；生長素釋放素；細胞；凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:692.)

心力衰竭（心衰）是多種原因導致心肌收縮和（或）舒張功障礙，心臟泵血功能降低，導致心輸出量減少，是各種器質性心臟疾病的共同結局。心衰一直是臨床上治療難題，不斷提出相關治療方案，但一直沒有取得明顯效果，目前醫學上仍沒有治療心衰的特效藥物。心肌細胞凋亡導致心肌細胞數量減少，心肌收縮力下降，并使存活心肌細胞負荷加重，導致心室重構，被認為是心衰發病的重要機制[1]。同時《中國心衰診斷和治療指南》2014版中明確指出心肌細胞凋亡是導致心衰的關鍵因素之一。

生長素釋放肽（GHRP）是一種人工合成的促分泌肽類物質。它能促使垂體生長素的釋放。相關研究證實，GHRP能促進心臟功能和心肌細胞損傷后的修復、抗心肌細胞凋亡等多方面的心肌保護作用[2-4]。最新的國際相關研究表明，GHRP可減輕心肌損害，抑制心肌細胞凋亡，且能增強心肌梗死大鼠心肌收縮力[5-8]。目前GHRP在抗心肌細胞凋亡的具體分子作用機制尚不明確。

Smac/DIABLO是一種與凋亡相關的線粒體蛋白質，在細胞受損時經線粒體凋亡途徑發揮促凋亡作用。近年來相關研究發現，心肌細胞內存在Smac/ DIABLO蛋白，并且參與心肌細胞凋亡的發生發展過程，心肌缺血缺氧和一些刺激因素誘導心肌細胞線粒體釋放Smac/DIABLO，其結合凋亡抑制蛋白（XIAP），導致天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-9和Caspase-3活化，促進細胞凋亡[9]。

B型白細胞/2型淋巴細胞樣蛋白（Bcl-2）基因是目前公認的重要抗凋亡蛋白，能抑制凋亡蛋白從線粒體中釋放[10，11]；同時Caspase-8在細胞凋亡過程中發揮重要作用，能激活幾乎所有凋亡相關級聯反應下游的Caspase，從而導致細胞凋亡[12]。因此本研究通過心肌缺血誘導大鼠建立心衰模型，通過檢測及觀察Smac/DIABLO、Bcl-2及Caspase-8等相關凋亡相關因子表達水平及GHRP干預后的變化，探討GHRP對心衰心肌細胞保護作用的可能分子機制，以期為心衰的進一步治療及研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料及分組

采用3月齡SD大鼠40只，雄性，SPF級，體重（220±20）g，實驗動物來源于佳木斯大學實驗動物中心，所有動物的使用均遵循美國國立健康研究所出版的《實驗動物照料和使用指南》及佳木斯大學實驗動物照料和使用規則，普通飼料飼養，自由飲水。隨機分為正常對照組10只、假手術組10只、心衰模型組10只、GHRP治療組10只。試劑：GHRP購自大連美侖生物技術有限公司；抗Smac/ DIABLO、抗Bcl-2抗體（美國Santa cruz公司）；Caspase-8活性測定試劑盒（中國普利萊公司）。儀器：HX-300動物呼吸機（中國成都泰盟公司）；BL-420F生物機能實驗系統（中國成都泰盟公司）；Leica DM4000B型生物顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2動物模型制備與藥物干預

（1）心衰大鼠模型的建立：采用結扎冠狀動脈左前降支方法，制作大鼠心衰模型。腹腔注射烏拉坦（1 g/kg）麻醉大鼠。將大鼠固定于動物實驗臺上，四肢皮下插入針形心電圖電極并與心電圖機連接，監測心率、心律、心電圖變化。留置針氣管插管連接呼吸機，呼吸機參數：潮氣量7~9 ml，呼吸頻率60次/min，呼吸比2：3。開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露第四肋間，剝開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界處下方3 mm穿過5-0帶針縫線，結扎左冠脈前降支。心電監測見Ⅱ導聯ST段明顯抬高，證實結扎成功，關胸。假手術組接受同樣的手術步驟，冠狀動脈左前降支只穿線不結扎。術后腹腔注射青霉素20萬U/d×3 d抗感染。（2）藥物干預：術后各組大鼠正常飼養4周，與此同時GHRP治療組經尾靜脈GHRP 100 μg/（kg·d），每天1次，持續4周；假手術組、心衰模型組給予等量生理鹽水尾靜脈注射，正常對照組不予處理。

1.3指標檢測

（1）M超聲心動圖觀察心臟功能：分別測量左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室射血分數（LVEF）。評價術后各組大鼠心臟功能狀態的改變情況。（2）心肌組織形態學觀察：各組大鼠處死后立即摘取心臟，距離心尖5 mm處橫斷心臟，福爾馬林固定36 h后，將組織塊依次脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、連續切片（厚約3~5 μm），采用蘇木素伊紅（HE）染色。封片后，用普通光學顯微鏡觀察各組心肌細胞的形態學改變。（3）應用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測各組大鼠心肌細胞Smac/ DIABLO和Bcl-2蛋白表達情況：各組大鼠處死后立即摘取心臟，生理鹽水沖洗，距離心尖5 mm處橫斷心臟，取適量左心室肌組織，按說明書提取蛋白，并進行蛋白定量。蛋白樣品經常規電泳分離后轉移于聚偏氟乙烯（PVDF）膜，封閉。抗體使用方法嚴格按照試劑盒說明操作步驟進行，電化學發光試劑盒發光顯影，X線膠片壓片曝光。用NIH圖像軟件分析蛋白表達量，以β-肌動蛋白（β-actin）為參考，測定Smac/DIABLO和Bcl-2的相對表達量。（4）Caspase-8活性的測定：按照Caspase-8活性測定試劑盒說明書，檢測心肌組織Caspase-8活性，用比色法在405 nm處測得吸光度值。根據標準品檢測所得的吸光度建立標準曲線，得到Caspase-8活性值。（5）應用流式細胞（FCM）技術檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況：心臟取材后，0℃生理鹽水沖洗，取左心室肌和室間隔。用顯微手術剪將心肌剪成約1 mm3的小塊，加0.5%膠原酶Ⅱ溶液（DMEM高糖液體培養基配制）10 ml，37℃水浴5 min后，輕輕吹打，吸取上層混懸液，放入DMEM中終止反應。重復消化細胞3次，800 rpm離心5 min，棄上清，加DMEM高糖液體培養基，差速培養24 h，備用。收集細胞懸液，800 rpm離心5 min；PBS液（0.2 mmol PH7.4）洗滌2次，在50μl的結合緩沖液中加入5 μl 7-AAD染液，混勻；室溫、避光，10 min；反應后再加入450 μl的Binding Buffer混勻；加入1 μl細胞凋亡檢測試劑（Annexin V-PE）混勻，室溫、避光，15 min；流式細胞儀分析。

1.4統計學處理

所有實驗數據全部采用SPSS Statistics 17.0進行統計。計數資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗/方差分析。計量資料采用卡方（χ2）檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠術后4周心功能檢測結果（表1）

心衰模型組及GHRP治療組的LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV均較對照組及假手術組明顯增加（P<0.05）；GHRP治療組與心衰模型組比較，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV均有顯著改善（P<0.05）；GHRP治療組LVEF較心衰模型組明顯增高（P<0.05）。

表1 各組大鼠術后4周心功能檢測結果（n=10,±s）

2.2各組大鼠術后4 周心肌形態學表現（圖1）

正常對照組和假手術組心肌細胞排列規律，核多位于細胞中部，無溶解。心衰模型組左心室前壁心肌細胞溶解消失，大量炎性細胞浸潤，膠原纖維增生；GHRP治療組左室前壁多可見殘存的心肌細胞，細胞核少見，肌漿紅染無結構，炎性細胞浸潤，膠原纖維增生。

圖1 各組大鼠術后4周左心室前壁蘇木素伊紅染色光鏡下圖片（×400）

2.3各組大鼠心肌細胞Smac/DIABLO和Bcl-2蛋白相對表達情況及Caspase-8活性比較（表2、圖2）

Western blot分析顯示，GHRP治療組Smac/ DIABLO表達水平較心衰模型組顯著降低（P<0.05），心衰模型組Bcl-2水平較其余三組明顯降低（P<0.05）；GHRP治療組Bcl-2表達水平較正常對照組明顯增高（P<0.05）。心衰模型組大鼠心肌組織Caspase-8活性較正常對照組及假手術組均顯著升高（P<0.05）；GHRP治療組心肌Caspase-8活性較心衰模型組顯著降低（P<0.05）。

表2 各組大鼠心肌細胞Smac/DIABLO和Bcl-2蛋白相對表達情況及Caspase-8活性比較（n=10,±s）

圖2 各組大鼠心肌Smac/DIABLO與Bcl-2蛋白水平比較的蛋白免疫印跡圖

2.4各組大鼠心肌凋亡指數比較

FCM結果顯示，心衰模型組（15.10±1.08）與正常對照組（5.20±0.52）、假手術組（5.78±0.63）比較，凋亡率均顯著升高（P均<0.05）；GHRP治療組（10.44±0.86）與心衰模型組比較，凋亡率明顯降低（P<0.05）,差異具有統計學意義。

3 討論

本研究通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法，心肌缺血誘導大鼠出現心衰，來模仿心肌梗死后導致的心衰的臨床事件。本研究顯示，心衰模型建立4周后，心衰模型組大鼠心功能明顯降低，說明心衰模型造模成功。

本研究通過GHRP干預大鼠的心衰模型，證明了GHRP能有效降低心衰大鼠的心肌細胞凋亡率，改善心衰大鼠的心臟功能，同時促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，維持線粒體膜的穩定性，抑制凋亡蛋白Smac/DIABLO及Caspase-8的表達，抑制心肌細胞的凋亡。

GHRP在抑制心肌細胞凋亡的具體分子作用機制尚不明確。在心肌細胞凋亡過程中，線粒體發揮著重要作用，是一條重要的細胞凋亡途徑，Bcl-2抗凋亡蛋白在其中發揮著重要作用[13]。Bcl-2 是一種抑制細胞凋亡的基因，凋亡相關基因Bcl-2相關X蛋白（Bax）則促進細胞凋亡，凋亡細胞內 Bcl-2 和Bax 的平衡狀態與凋亡調控直接相關[14]。線粒體膜通透性和凋亡蛋白的釋放受Bcl-2家族蛋白的調節。在心肌細胞中，氧化應激能夠使Bax的表達增加，Bcl-2表達下降，導致線粒體膜通透性增高，使細胞發生凋亡[15]。既往研究證實，Smac/DIABLO與其他凋亡調節因子在線粒體調控凋亡的途徑中，Bcl-2表達的降低及Bax的升高會導致線粒體膜通透性轉換孔的開放，從而釋放前凋亡因子及細胞色素C等至胞漿中，細胞色素C釋放的同時，Smac/DIABLO也從線粒體的膜間隙中釋放出來，Caspase-8激活，使線粒體是通過凋亡細胞蛋白酶激活因子（Apaf-1）的多聚化，進而激活Caspase-9和Caspase-3，使Caspase-3酶原水解形成具有分解蛋白質活性的Caspase-3發揮凋亡執行功能，啟動凋亡程序，最終導致線粒體途徑的細胞凋亡[16-18]。Smac的高表達可促進Apo-2L/TRAIL誘導的Caspase-8的加工和線粒體細胞色素C的釋放，同時Caspase-8通過級聯反應能促使成熟的Smac蛋白迅速釋放到細胞漿中，進一步引起Caspase-3的激活促進細胞凋亡的惡性循環。本研究發現，經GHRP治療后的大鼠，Bcl-2表達增高，同時伴有Smac/DIABLO及Caspase-8表達的降低，通過Bcl-2穩定線粒體膜穩定性，抑制細胞色素C及Smac/DIABLO蛋白向胞漿的轉位，抑制線粒體途徑的心肌細胞凋亡，從而改善心衰大鼠的心功能。

既往研究證實，Caspase-8在細胞凋亡過程中處于核心地位，幾乎能激活所有凋亡級聯反應下游的Caspase而誘發凋亡，可同時參與外源性（死亡受體途徑）和內源性（線粒體途徑）細胞凋亡途徑。本研究結果顯示，心衰模型組大鼠心肌細胞Caspase-8活性明顯增強，經GHRP干預后活性明顯下降，不除外GHRP可通過抑制外源性細胞凋亡途徑發揮抗心衰作用，需進一步的研究證實。本研究還通過光鏡觀察各組心室前壁梗死區心肌細胞結構發現，GHRP治療組的心肌細胞結構較心衰模型組更為完整，炎性細胞浸潤相對減少，間質膠原纖維增生較少，說明GHRP能減輕心肌細胞的損傷。

GHRP最早是由Bowers[19]領導的研究組合成的一種5~7個氨基酸的短肽，它具有很強的刺激生長素釋放的功能，同時還有許多其他神經內分泌活性，這些作用主要是通過分布于垂體和下丘腦的特異性受體，這些受體亦存在于中樞神經系統的其他區域及心臟等一些外周組織。相關研究表明，長期給予GHRP可以保護由于缺血再灌注引起的正常和生長激素（GH）缺乏大鼠的心肌損害且能增強心肌梗死大鼠心肌收縮力。給予正常和有嚴重GH缺乏的患者GHRP可增加其LVEF。結合本研究結果說明，GHRP可通過提高Bcl-2的表達，抑制細胞內Smac/ DIABLO及細胞色素C經線粒體中釋放至胞漿，通過線粒體相關的凋亡通路起促進心肌細胞存活的保護作用。

綜上所述，GHRP具有抑制心肌細胞凋亡的抗心衰作用，其機制可能部分通過抑制線粒體介導的內源性心肌細胞凋亡的途徑實現。本研究通過GHRP治療大鼠心肌缺血誘導的心衰，取得了滿意的效果，可為進一步的臨床防治心力衰竭提供新的靶點及思路。

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Preliminary Research for the Effect of Growth Hormone Releasing Peptide on Myocardial Cell Apoptosis in Heart Failure Rats

CAO Jin-song, XING Yu-tong, LIU Jun-yan, WANG Gao-lei, ZHOU Gang, XIAO Ming-di.
Department of Cardiac Surgery, The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi (154007), Heilongjiang, China

XING Yu-tong, Email: Email: xingyt@163.com

Objective: To explore the effect of growth hormone releasing peptide (GHRP) on myocardial cell apoptosis in heart failure (HF) rats.

Methods: Rat’s HF model was established by the ligation of left anterior descending coronary artery induced ischemia. 40 male SD rats were randomly assigned into 4 groups: Normal control group, Sham operation group, HF group and GHRP treated HF group. n=10 in each group and the rats were fed for 4 weeks after the operation. Cardiac function was examined and myocardial cell morphology was observed; protein expressions of Smac/DIABL0 and Bcl-2 were measured by Western blot analysis; cell apoptosis was evaluated by FCM technique. The differences for above parameters were compared among groups to explore the effect of GHRP on myocardial cell apoptosis in HF rats.

Results: Compared with HF group, GHRP treated HF group showed the less heart dilation, higher LVEF, lighter pathological changes in myocardial cells and decreased protein expression of Smac/DIABL0, all P<0.05. Bcl-2 level was lower in HF group than the other 3 groups, P<0.05. Compare with Normal control group, GHRP treated HF group had elevated Bcl-2 level, all P<0.05. Myocardial cell apoptosis index was different between HF group and GHRP treated HF group, P<0.05.

Conclusion: The effect of GHRP on anti-HF should be via inhibiting myocardial cell apoptosis; the mechanism may partly be through promoting Bcl-2 protein expression and depressing Smac/DIABLO mediated mitochondrial pathway of apoptosis.

Heart failure; Growth hormone releasing peptide; Cells; Apoptosis

2016-09-17）

（編輯：王寶茹）

佳木斯大學研究生科技創新項目（YZ2016_027）

黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學附屬第一醫院 心臟外科（曹勁松、邢宇彤、劉俊琰、汪高磊、周剛）；上海遠大心胸醫院（肖明第）

曹勁松 碩士研究生 主要從事心臟外科方面研究 Email：630282877@qq.com 通訊作者：邢宇彤 Email：xingyt@163.com

R54

A

1000-3614（2017）07-0692-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.07.017