培養條件對黑曲霉脂肪酶選擇性合成1,3甘油二酯的影響

張富豪，李蘭香，何臘平，2*，高冰，李翠芹，陳翠翠

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

培養條件對黑曲霉脂肪酶選擇性合成1,3甘油二酯的影響

張富豪1，李蘭香1，何臘平1，2*，高冰3，李翠芹4，陳翠翠1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

從前期篩菌工作中得到的一株能高選擇性合成1,3-甘油二酯（1,3-DAG）的產胞內脂肪酶的黑曲霉GZUF36菌株出發，分別研究了培養時間、溫度、接種量、裝液量和轉速對該菌搖瓶發酵的影響，得出合適的培養條件為培養時間72 h，接種量3%，裝液量40 mL/250 mL，培養溫度28℃，轉速180 r/min，在此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%和82.96%。同時也比較了搖瓶發酵和5 L發酵罐發酵的異同，相比于搖瓶發酵，5 L發酵罐發酵的1,3-DAG的得率有所提高，但是發酵罐發酵的時間有所延長。

1,3-甘油二酯；脂肪酶；發酵條件；搖瓶；發酵罐

肥胖已經成為全球性的、嚴重的社會公共衛生問題，全球有3億人患有嚴重肥胖癥。肥胖可以引發多種疾病，如高血壓、冠心病、腦血管疾病等。引起肥胖的一個主要原因是攝入油脂過多，但是油脂也是不可或缺的重要營養素之一。甘油三酯（triglyceride，TAG）和甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是食用油脂中的天然成分，其中甘油二酯存在三種同分異構體：1,2-DAG、2,3-DAG和1,3-DAG[1]。TAG、1,2-DAG、2,3-DAG在人體中不能徹底轉換為能量并在體內重新合成油脂而積累，從而引起肥胖。而1,3-DAG能在體內分解成不能重新合成脂肪的1-單酰基甘油酯，通過β氧化以能量的形式釋放，不會在體內積累[2]，并且1,3-DAG和傳統的油脂在口感、色澤、風味都沒有差異，同時動物和人體實驗都發現，富含1,3-DAG食用油能減少肥胖的發生[3-4]，所以1,3-DAG被公認為新一代的健康油脂。

天然油脂中1,3-DAG的含量很低，目前主要采用化學法和生物酶法來合成。由于化學法對環境破壞較大，所以生物酶法備受關注。脂肪酶是1,3-DAG酶法制備中常用的一種催化劑，1,3-DAG的脂肪酶法制備包括酯合成、甘油解、轉酯化法、甘油三酯水解四種[5]，其中甘油解法相比于其他方法，具有反應中無凈水產生、成本低、反應條件易控制的優點，但是需要有1,3-選擇性的脂肪酶催化[6]。脂肪酶對于三酰甘油特定位置的脂肪酸優先水解，主要是1位和3位，因此被稱為Sn-1,3位專一性脂肪酶，而具有1,3-選擇性的脂肪酶不多，產該脂肪酶的菌株更為稀少。本課題組在前期篩菌過程中得到了一株通過甘油解反應高選擇性合成1,3-DAG的產胞內脂肪酶的菌株黑曲霉GZUF36[7]，其產的胞內脂肪酶被用作全細胞脂肪酶，可以節省純化工藝降低成本。由于培養環境條件會對產酶具有重要影響[8-10]，因此本實驗對該菌株生長的培養環境條件進行了探索，以確定合適的條件來提高該菌株全細胞脂肪酶高選擇性合成1,3-DAG的能力，同時將搖瓶發酵擴大到5 L發酵罐發酵培養，以此來獲得大量脂肪酶供后續研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

本課題組在富含油脂的土壤中篩選得到的一株黑曲霉（Aspergillus niger）GZUF36菌株，該菌株能通過甘油解反應高選擇性合成1,3-DAG，由中國典型培養物保藏中心鑒定并保藏，保藏編號為CCTCC No.M2012538。

1.1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖0.96%，豆餅粉1.93%，氯化鉀0.048%，硫酸鋅0.044%，氯化鈣0.044%，磷酸氫二鈉0.044%，磷酸氫二鉀0.044%，水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

橄欖油（生物試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；三油酸甘油酯（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；叔丁醇、異丙醇、乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國產分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；GBJS-5LS發酵罐：上海百倫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全細胞脂肪酶制備

挑取保藏于試管斜面中的黑曲霉兩環接種到種子培養基中，在30℃、180 r/min的搖床中振蕩培養24 h，吸取3%種子培養基液體接種到發酵培養基中，在30℃，180 r/min的搖床中振蕩培養72 h。用干凈的紗布過濾得到菌體，用無菌水沖洗菌體3遍以除去菌體表面上的發酵液，之后在冷凍干燥機中凍干并在液氮的保護下碾磨成酶粉，即為全細胞脂肪酶酶粉，并于4℃保藏備用。

1.3.2 反應體系條件

甘油解反應體系為有機溶劑體系，有機溶劑由正己烷和叔丁醇組成，兩者的體積比為49∶1；反應底物為甘油和甘油三酯，兩者的摩爾比為1∶2，其中，甘油三酯的濃度為0.01mol/L；酶粉添加量為0.2g；于50mL錐形瓶中反應，反應條件為30℃，180 r/min條件下反應12 h，反應完成后取1 mL反應液經過膜過濾進入高效液相色譜檢測1,3-DAG的含量。

1.3.3 高效液相色譜檢測條件

采用Agilent 1206高效液相色譜儀，流動相為乙腈和異丙醇，WatersC18反相色譜柱（4μm，3.9mm×150mm）。檢測條件為：0min時，乙腈：異丙醇=80∶20（V/V）；27min時，乙腈∶異丙醇=40∶60（V/V）；進樣量為10 μL；流速為0.6 mL/min；柱溫為30℃[7]。

1.3.4 培養環境條件對黑曲霉GZUF36產胞內脂肪酶的影響

（1）培養時間

固定發酵培養基的接種量3%、裝液量50 mL/250 mL，培養溫度30℃、培養轉速180 r/min，研究不同的培養時間（24 h、48 h、72 h、96 h和120 h）對黑曲霉發酵所產的脂肪酶參與甘油反應中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（2）接種量

在上述合適的培養時間條件下，固定裝液量50 mL/ 250 mL，培養溫度30℃、培養轉速180 r/min，研究不同的接種量（1%、2%、3%、4%、5%和6%）對黑曲霉發酵所產的脂肪酶參與甘油反應中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（3）裝液量

在上述合適的培養時間和接種量條件下，固定培養溫度30℃、培養轉速180r/min，研究不同的裝液量（30mL/250mL、40mL/250mL、50mL/250mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80 mL/250 mL和90 mL/250 mL）對黑曲霉發酵所產的脂肪酶參與甘油反應中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（4）培養溫度

在上述合適的培養時間、接種量和裝液量條件下，固定搖床轉速180 r/min，考察不同的培養溫度（26℃、28℃、30℃、32℃和34℃）對黑曲霉發酵所產的脂肪酶參與甘油反應中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（5）搖瓶轉速

在上述合適的培養時間、接種量、裝液量、培養溫度條件下，變化培養轉速，其他條件一致，研究不同的培養轉速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min）對黑曲霉發酵所產的脂肪酶參與甘油反應中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

1.3.5 5L發酵罐擴大實驗

根據搖瓶發酵培養條件的探索，黑曲霉GZUF36在發酵罐中的培養條件為接種量為3%，裝液量為3.5 L/5.0 L，溶氧量為1.7%，攪拌轉速為180 r/min，培養溫度為28℃，用氨水和醋酸來調節發酵罐中的pH。每12h取一次樣，取樣量為50 mL，取樣后注入相同體積的滅菌的新鮮培養基。樣品經過紗布過濾得到菌體，冷凍干燥、液氮碾磨制成酶粉，加入甘油解反應體系中參與反應，用高效液相色譜檢測1,3-DAG的含量。

1.3.6 數據計算

1,3-DAG選擇性為甘油二酯產物中1,3-DAG所占的比例，也是脂肪酶1,3-位選擇性強弱的直觀表現。1,3-DAG的得率和選擇性計算公式如下。

式中：1,2-DAG和1,3-DAG分別為1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯；TAG為三油酸甘油酯。

1.3.7 數據分析

所有實驗均設置3個平行，所有實驗組的數據均由3個平行數據的平均值求得，用SPSS 19.0版分析數據差異顯著性，P＜0.05時差異顯著，用Origin 8.6對實驗數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 培養時間對1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖1 培養時間對1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.1 Effects of culture time on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖1可知，隨著培養時間的增加，1,3-DAG的得率和選擇性都呈現先上升后下降的趨勢。當培養時間低于72 h時，1,3-DAG的得率和選擇性都沒達到峰值，這是由于此時微生物還處于大量繁殖階段，該階段微生物主要以分泌初級代謝產物為主；當培養時間為72 h時，微生物已經進入了穩定期，細胞代謝產物如脂肪酶大量生產[11]，從而甘油解反應得到更多的1,3-DAG；但超過72 h后，1,3-DAG的得率和選擇性都呈下降趨勢，這是由于培養基中的營養物質大量消耗，微生物進入衰亡期從而產酶能力下降。當培養時間為72和96 h時，兩者的1,3-DAG的選擇性沒有顯著差異（P＞0.05），但是1,3-DAG的得率卻差異顯著（P＜0.05），且培養72 h的更高。所以較為合適的培養時間為72 h，在此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為20.45%和77.13%。

2.2 接種量對1,3-DAG的得率和選擇性的影響

由圖2可知，1,3-DAG的得率和選擇性均隨著接種量的增大呈現先增加后下降的趨勢，在接種量為3%時達到最大值（P＜0.05），此時1,3-DAG的得率和選擇性分別為20.88%和76.63%。當接種量為1%～3%時，兩個指標呈現增加的趨勢，這是由于當接種量過低時，微生物的對數期過長，生物量增長緩慢，達到穩定產酶期的時間過長從而產酶量較低[11]。當接種量為3%時，此時菌體生物量和培養基中的營養物的配比較合理，能更快達到穩定產酶期，產酶效率增加[12]。當接種量＞3%時，由于過大的接種量會極大的縮短微生物的發酵周期，菌體更容易衰亡，同時過多的接種量會帶入過多的種子培養基中的有害物質從而導致微生物衰亡更快，產酶效率也越低[13]，所以選擇接種量為3%較為合適。

圖2 接種量對1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.2 Effects of inoculum on the yield and selectivity of 1,3-DAG

2.3 裝液量對1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖3 裝液量對1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.3 Effects of liquid volume on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖3可知，隨著裝液量的增加1,3-DAG的得率和選擇性先增加后下降。當裝液量低于40 mL/250 mL時，由于裝液量過低，會導致一次發酵生產的脂肪酶的量過低，即總酶活力會低，所以甘油解反應產物1,3-DAG的含量也偏低。當裝液量高于40 mL/250 mL時，由于培養基量增大會導致溶氧量的下降，微生物生長和發酵得不到足夠的氧，進而影響代謝途徑，降低了產酶能力[8]。當裝液量為30 mL/250 mL和40 mL/250 mL時，兩者的1,3-DAG的選擇性沒有顯著差異（P＞0.05），但是1,3-DAG的得率卻差異顯著（P＜0.05），且后者效果更好。所以選擇裝液量為40 mL/250 mL作為后續實驗的條件，此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為21.72%和78.37%。

2.4 培養溫度對1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖4 培養溫度對1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖4可知，隨著溫度的上升，1,3-DAG的得率和選擇性先增加后快速下降。這是由于溫度過低時，微生物生長緩慢，遲滯期和對數生長期時間過長，產酶效率低，所以培養溫度為26℃條件下1,3-DAG的得率和選擇性較低[14]。但是當溫度高于28℃時，由于溫度過高，微生物生長迅速容易老化，降低了酶產率。并且溫度還會對誘導產酶的代謝機制產生影響，過低或者過高的溫度都會降低脂肪酶的產量，甚至出現不能誘導產酶的情況發生[15]。所以選擇培養溫度為28℃作為后續實驗條件（P＜0.05），在該條件下1,3-DAG的得率和選擇性均較優，分別為22.81%和82.83%。2.5培養轉速對1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖5 培養轉速對1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.5 Effects of rotation speed on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖5可知，1,3-DAG的得率和選擇性均呈現同步先增后減。當培養轉速低于180r/min時，培養基中傳氧受到了限制，微生物生長較慢，同時在發酵液表面也容易形成菌絲體膜阻礙微生物與氧的接觸，從而導致脂肪酶產量偏低[16]；但培養轉速高于180 r/min時，過高的轉速又會使微生物因為溶氧增多而大量繁殖較早形成菌絲球或菌絲團，由于菌絲球或菌絲團內部傳質和傳氧受到了一定的限制，從而阻礙了微生物的生長，進一步影響產酶[17]。因此當培養轉速為180 r/min時效果較好（P＜0.05），此時的1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%和82.96%。

2.6 5 L發酵罐的擴大試驗

發酵罐試驗有助于為后續的潛在工業化大規模發酵摸索合適的培養條件，同時也可以探討搖瓶（小試）和5 L發酵罐（中試）的兩種培養方式對GZUF36選擇性的影響，為后續研究提供借鑒，結果見圖6。

圖6 發酵罐的擴大培養Fig.6 Enlarge cultivation of the fermentation tank

如圖6所示，黑曲霉GZUF36在5 L發酵罐中培養時，在培養了96h時才呈現最大的脂肪酶活力，1,3-DAG的得率和選擇性分別為25.30%，82.02%，而搖瓶發酵的培養時間則為72 h，1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%，82.96%。相比于搖瓶發酵培養，發酵罐發酵培養的最佳1,3-DAG的得率要高。這可能是因為搖瓶培養是一次投料，一次發酵的分批發酵方式，而發酵罐發酵采用補料分批發酵方式，這可以延長發酵周期，添加的新鮮培養基有利于微生物的產酶和生長[18]。同時由于機械攪拌式發酵罐的攪拌會改變絲狀真菌發酵液的流動特性，影響菌體的聚集形態[19]，因此相比于搖瓶發酵，其產酶能力也有所改變。

3 結論

通過試驗研究了培養時間、接種量、裝液量、培養溫度和轉速對黑曲霉GZUF36菌株產的全細胞脂肪酶高選擇性合成1,3-DAG能力的影響。得出合適的搖瓶培養條件為培養時間72 h，接種量3%，裝液量40 mL/250 mL，培養溫度28℃，培養轉速180 r/min，在此條件下得到的1,3-DAG的得率和選擇性，分別為23.87%和82.96%。

該研究還比較了搖瓶發酵和5 L發酵罐發酵對培養效果的影響，研究發現當黑曲霉GZUF36在5 L發酵罐的培養時間為96 h時，1,3-DAG的得率和選擇性達到最大，分別為25.30%、82.02%。相比于搖瓶發酵，5 L發酵罐發酵的結果有所提高，但是發酵罐發酵的時間有所延長，這可能是因為搖瓶培養和發酵罐培養的方式不同導致的，但是發酵罐發酵培養的條件在后續研究中需進一步探索，為后續的潛在工業化應用進一步摸索合適條件。

[1]MORITA O,SONI M G.Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil:a review of the published literature[J].Food Chem Toxicol, 2009,47(1):9-21.

[2]王衛飛.酶法甘油解合成甘油二酯工藝的研究[D].廣州：華南理工大學，2012.

[3]TAEKIL E,KONG CS,HEEGUK B,et al.Lipase catalytic synthesis of diacylglycerol from tuna oil and its anti-obesity effect in C57BL/6J mice. [J].Process Biochem,2010,45(5):738-743.

[4]董攀.脂肪酶水解法制備1,3-甘油二酯及脂肪酶的固定化研究[D].南昌：南昌大學，2013.

[5]何臘平，李蘭香，周換景，等.1,3-甘油二酯的制備研究進展[J].食品研究與開發，2013，34（15）：113-116.

[6]FREGOLENTE P B L,FREGOLENTE L V,PINTO G M F,et al.Monoglycerides and diglycerides synthesis in a solvent-free system by lipasecatalyzed glycerolysis[J].Appl Biochem Biotechnol,2008,146(1):165-172.

[7]ZHOU H J,HE L P,WANG H,et al.Screening intracellular lipase-producing microbial with selective synthesis of 1,3-diolein[J].J Pure Appl Microbiol,2014,8(3):1853-1856.

[8]LIU WH,BEPPU T,ARIMA K.Cultural conditions and some properties of the lipase of S-38[J].Agr Biol Chem,2014,36(11):1919-1924.

[9]劉金輝，李曉路，姜巖，等.施氏假單胞菌PS59產脂肪酶發酵條件及脂肪酶洗滌性能優化[J].生物技術通報，2016，32（7）：186-193.

[10]趙興秀，趙長青，何義國，等.高產脂肪酶菌株的篩選及產酶條件研究[J].食品與機械，2016，32（3）：16-19.

[11]惲麗紅.Burkholderia manaSYBC LI-1產脂肪酶發酵條件優化及酶學性質研究[D].無錫：江南大學，2008.

[12]REN X,PAN D,ZENG X,et al.Optimization of culture conditions and fermentation conditions for cell wall proteinase(CEP)production by Lactobacillus acidophilus[J].J Chinese Inst Food Sci Technol,2014, 14(2):146-153.

[13]胡珺，杜新凱，王常高，等.產脂肪酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化[J].中國釀造，2016，35（11）：39-43.

[14]王棟.華根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶學特性的研究[D].無錫：江南大學，2008.

[15]李燕.根霉ZM-10脂肪酶發酵條件及酶學性質研究[D].泰安：山東農業大學，2007.

[16]顏興和.提高華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶酶促催化酯合成能力的研究[D].無錫：江南大學，2004.

[17]HE D,LUO W,WANG Z,et al.Combined use of GAP,and AOX1, promoters and optimization of culture conditions to enhance expression ofRhizomucor miehei,lipase[J].J Ind Microbiol Biot,2015,42(8): 1175-1182.

[18]PAPAGIANNI M.Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial processes[J].Biotechnol Adv,2004,22(3):189-259.

[19]ZNIDARSIC P,KOMEL R,PAVKO A.Studies of a pelleted growth form ofRhizopus nigricans,as a biocatalyst for progesterone 11 α-hydroxylation[J].J Biotechnol,1998,60(3):207-216.

Effect of culture conditions on the synthesis of 1,3-DAG by the lipase fromAspergillus niger

ZHANG Fuhao1,LI Lanxiang1,HE Laping1,2*,GAO Bing3,LI Cuiqin4,CHEN Cuicui1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Aspergillus nigerGZUF36 with extracellular lipase-producing ability which can highly synthesize 1,3-diglyceride was screened from early screening work.The effects of incubation time,temperature,inoculum,liquid volume,and rotation speed on the shake-flask fermentation were studied.The suitable cultivate conditions were found as followed:incubation time 72 h,inoculum 3%,liquid volume 40 ml/250 ml,temperature 28℃, rotation speed 180 r/min.In this condition,the yield and selectivity rate of 1,3-DAG was 23.87%and 82.96%,respectively.The similarities and differences of shake-flask fermentation and 5 L fermentor fermentation were compared,and results showed that the yield of 1,3-DAG was improved by 5 L fermentor fermentation,but the fermentation time extended.

1,3-diglyceride;lipase;fermentation condition;shake-flask;fermentor

Q935

0254-5071（2017）07-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.019

2017-04-10

國家自然科學基金（21062004、31660010）；貴州大學研究生創新基金（研理工2016059）

張富豪（1991-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、生物催化與生物轉化。