液氮保種對田鼠巴貝蟲標準株存活力的影響

蔡玉春，陳家旭，盧 艷，艾 琳，吳 芬，陳韶紅

?

液氮保種對田鼠巴貝蟲標準株存活力的影響

蔡玉春1，2，陳家旭1，盧 艷1，艾 琳1，吳 芬1，陳韶紅1

目的 探索液氮保種對田鼠巴貝蟲標準株存活力的影響。方法 液氮保種1、3、6、9個月的田鼠巴貝蟲標準株小鼠血室溫復蘇后感染正常BALB/c小鼠各3只(復蘇1代，實驗組)， 100 μL/只；同時取3只新感染田鼠巴貝蟲活體保藏小鼠為對照組。實驗組染蟲率達高峰時再接種正常BALB/c小鼠(復蘇2代)，觀察田鼠巴貝蟲的形態變化及增殖情況，并觀察不同保存時間復蘇1代及復蘇2代的染蟲率情況。結果 液氮保種田鼠巴貝蟲與活體保種的田鼠巴貝蟲相比，形態變化不大，都會出現小滋養體、環狀滋養體、裂殖體及未成熟和成熟裂殖子等多種形態。液氮復蘇1代首次查見蟲體及達到染蟲率高峰的時間比動物保種延遲1～2 d，但復蘇2代即恢復一致。田鼠巴貝蟲染蟲全血經液氮保存1、3、6、9個月，僅達到高峰期時間延遲，其存活力未見明顯下降。結論 液氮保種對田鼠巴貝蟲形態及存活力影響小，可成為一種較好的保存方式。

田鼠巴貝蟲；液氮保種；動物保種；存活力

巴貝蟲在分類學上屬于頂復門(phylum Apicomplexa)、孢子蟲綱(Class Sporozose)、梨形蟲亞綱(Subclass Prioplasmasina)、梨形蟲目(Order Prioplasmida) 巴貝科(Family Babesidae)[1]。常見可感染人體的巴貝蟲為田鼠巴貝蟲(Babesiamicroti)、牛巴貝蟲(B.bovis)、歧異巴貝蟲(B.divegen)、馬巴貝蟲(B.equi)，其中以田鼠巴貝蟲感染為多見[2],是一種重要的人獸共患血液原蟲病。近年來，在美國[3]等國家被定為法定須呈報傳染病，已經成為世界范圍內影響人類健康的新威脅[4]。人體感染巴貝蟲病是通過蜱的叮咬，其病原體巴貝(Babesidae.spp)蟲體隨唾液進入人體，侵染紅細胞，引起紅細胞破壞溶血,因此有蜱叮咬史且貧血是本病的典型癥狀。大多數病例癥狀是輕的，隱性的或自限性的，但對于年老或脾切除者等免疫力低下的人群或者患艾滋病等免疫缺陷患者可引起嚴重癥狀，甚至死亡[5]。據資料顯示，截止2014年，我國有存活艾滋病感染者和病人448 226例，死亡138 956例[6]；作為發展中國家，我們的癌癥發病率也居高不下[7]，而這些人群都是巴貝蟲病感染的潛在人群，巴貝蟲病在我國隨時可能暴發；另外，巴貝蟲病還可通過輸血傳播，由于我國對血源尚無檢測巴貝蟲的要求，這在輸血時會造成很大的危害[8]。此前我國對巴貝蟲病關注較少，巴貝蟲病的致病機制還不明確，臨床診治及防控技術和策略等知識、技能和技術貯備都很匱乏，亟需開展此類疾病的科學研究工作，因此對已有巴貝蟲株的長期持續保種顯得尤為重要。常用的保種方法為動物模型傳代法。目前已經建立有BALB/c小鼠、SCID小鼠和NOD-SCID小鼠3種動物模型[9]。但動物轉種操作繁瑣，成本較高，而且易發生遺傳漂變、人為差錯或混淆等問題[10]。隨著冷凍技術及預防醫學的發展[11]，寄生蟲的低溫保藏技術也蓬勃發展，低溫保存技術不僅能克服傳統保存方法的弊端，而且能延長寄生蟲存活時間，保持其原有的生物學特性，瘧原蟲[10]、弓形蟲[12]、利氏曼原蟲[13]等寄生蟲已經有較好的低溫保藏技術。本研究擬在探索液氮保種對田鼠巴貝蟲標準株存活力的影響，以建立田鼠巴貝蟲的低溫保藏方法，為田鼠巴貝蟲的研究及巴貝蟲病的藥物篩選、免疫診斷和預防，也為建立“寄生蟲保藏庫”提供簡便、實用的方法。

1 材料與方法

1.1 蟲株與小鼠 田鼠巴貝蟲(Babesiamicroti)，peabodymjr株購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)，貨號: PRA-99。BALB/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑 顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，EDTA抗凝采血管(浙江拱東醫療科技有限公司)，0.9%生理鹽水(上海長富制藥公司)，地塞米松(山東新華制藥公司)，吉姆薩染液原液(上海怡成生物科技公司)，甲醇(上海振興化工一廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物轉種 感染種鼠(紅細胞染蟲率，即蟲密度為60%)眶竇取血，置EDTA抗凝采血管中，在無菌條件下以1∶3比例加0.9%生理鹽水，使蟲密度約為20%，腹腔接種10只正常BALB/c小鼠，100 μL/只。

1.3.2 蟲株液氮保存 取8只感染田鼠巴貝蟲蟲密度為60%的種鼠全血在無菌條件下加等體積的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)，將已封口的凍存管放入液氮罐的提筒，先置于液氮罐口14 cm處，該處預測為-70 ℃，30 min后，置于液氮中凍存。

1.3.3 蟲株復蘇 分別將液氮保存后1月、3月、6月、9月的含蟲血各取出1只，放常溫下靜置，使其自然融化。取融化后血樣與無菌0.9%生理鹽水混合稀釋為染蟲率20%，經腹腔注射感染BALB/c小鼠各3只，100 μL/只；同時取動物保種種鼠血以相同的感染率新轉種3只正常BALB/c小鼠，為動物保種對照組。動物接種當天記為第0 d(d0)，接種次日開始觀察記為第1 d(d1)。自d1開始每天通過尾靜脈采血，涂制薄血片、姬姆薩氏染液染色，油鏡下觀察田鼠巴貝蟲的形態、增殖情況，記錄紅細胞的感染率。待BALB/c小鼠的感染率達到高峰期，再以相同劑量腹腔接種正常BALB/c小鼠，為復蘇2代，觀察田鼠巴貝蟲的增殖情況及不同保存時間復蘇1代及復蘇2代的染蟲率情況。

2 結 果

2.1 活體轉種與液氮保存復蘇巴貝蟲形態比較 田鼠巴貝蟲在活體轉種的BALB/c小鼠中，在感染初期出現少量環狀滋養體，第7 d達到染蟲高峰，紅細胞內出現大量蟲體，紅細胞裂解，蟲體形態各異，小環狀滋養體、大環狀滋養體、長絲狀裂殖體、未成熟及成熟裂殖子等，有些為兩蟲、三蟲寄生，有嚴重的紅細胞溶血現象。在感染后期，染蟲紅細胞明顯大量減少，每視野中僅見2～4個環狀體。經液氮保存1，3，6，9個月后，復蘇傳代，觀察到不同保存時間的蟲體形態未見明顯改變，在感染初期，仍可見少量點狀滋養體及小環狀滋養體，感染高峰期仍可見較多大滋養體及長絲狀、阿米巴狀裂殖體、未成熟及成熟裂殖子，也可見溶血現象，在感染后期蟲體大量被清除，僅可見少量點狀及環狀滋養體(見圖1)。

2.2 活體轉種與液氮保存復蘇染蟲率的變化比較 液氮保存1，3,6,9個月復蘇轉種1代染蟲率高峰值在58%～61%之間，不同保存月份未見明顯差異。復蘇轉種1代初次查見蟲體的時間在第2～3 d，比活體轉種延遲1～2 d，但復蘇2代首次查見蟲體的時間與活體轉種首次查見蟲體的時間一致。液氮保存復蘇轉種1代達到染蟲高峰期時間是第9～10 d，比活體轉種延遲2～3 d，但復蘇2代達到染蟲高峰期時間與活體轉種達到染蟲高峰期時間一致。在感染高峰時段，活體轉種的染蟲率最高，可達85%，其次是復蘇2代，可達70%～73%，復蘇一代均較低，為58%～61%之間。不同保存月份的復蘇1代及2代在感染后期基本一致，都在第20 d染蟲率降為0.5%(見表1)。

圖1 液氮復蘇對田鼠巴貝蟲形態的影響Fig.1 Effect of liquid nitrogen freezing and redissolution to form change of B. microti

表1 活體保種和液氮復蘇對田鼠巴貝蟲染蟲率變化的影響

Tab.1 Impact of infection rate ofB.microtiof BALB/c mice infection and liquid nitrogen freezing and redissolution

傳代數(Generations)感染天數(Daysofinfection)感染初期(Earlystageofinfection)感染高峰(Infectionpeaks)感染后期(Latestageofinfection)活體轉種對照組(Animalconservationcontrolgroup)d1(0．5%)d7(85%)d20(0．5%)復蘇1代/液氮保存1個月(thefirstgenerationafterredissolution/1month)d2(0．5%)d9(65%)d20(0．5%)復蘇2代/液氮保存1個月(thesecondgenerationafterredissolution/1month)d1(0．5%)d7(73%)d20(0．5%)復蘇1代/液氮保存3個月(thefirstgenerationafterredissolution/3months)d3(0．5%)d9(61%)d20(0．5%)復蘇2代/液氮保存3個月(thesecondgenerationafterredissolution/3months)d1(0．5%)d7(71%)d20(0．5%)復蘇1代/液氮保存6個月(thefirstgenerationafterredissolution/6months)d3(0．5%)d9(58%)d20(0．5%)復蘇2代/液氮保存6個月(thesecondgenerationafterredissolution/6months)d1(0．5%)d7(70%)d20(0．5%)復蘇1代/液氮保存9個月(thefirstgenerationafterredissolution/9months)d3(0．5%)d10(58%)d20(0．5%)復蘇2代/液氮保存9個月(thesecondgenerationafterredissolution/9months)d1(0．5%)d7(70%)d20(0．5%)

2.3 不同時間液氮保存復蘇后染蟲率的變化情況 田鼠巴貝蟲染蟲全血經液氮保存1個月，3個月，6個月，9個月，取出后接種BALB/c小鼠，為復蘇1代，保存1個月、3個月，6個月，9個月后感染7 d染蟲率分別為為23%、17%、20%和19%。復蘇2代4個不同保存時間的7 d染蟲率分別為73%、71%、70%和70%，見表2。

表2 不同時間液氮冷凍保存復蘇對田鼠巴貝蟲存活率影響評價

Tab.2 Evaluation of effect of liquid nitrogen freezing and redissolution to survival rate ofBabesiamicrotiin different time

保存時間(Storagetime)1個月(1month)3個月(3months)6個月(6months)9個月(9months)復蘇1代(thefirstgenerationafterredissolution)23%17%20%19%復蘇2代(thesecondgenerationafterredissolution)73%71%70%70%

接種時染蟲率20%，感染后7 d數據 (the infection rate of intraperitoneal injection is 20%，the infection data is the data of seven days after infection)

3 討 論

目前，田鼠巴貝蟲保藏方法多為動物模型活體傳代，但是，由于此蟲種保藏周期短，需要大量的小鼠作為傳代動物，浪費了大量人力和物力。而低溫生物學自上世紀已廣泛應用于醫學研究的各個領域,在寄生蟲領域的應用也十分廣泛，特別是瘧原蟲、利氏曼原蟲等原蟲的液氮保存。在本研究中，我們對田鼠巴貝蟲的活體保藏和液氮保藏進行了對比實驗。首先比較了活體保種與液氮保種的田鼠巴貝蟲形態及存活率的變化，比較發現，兩種保存形式對田鼠巴貝蟲的形態影響較小，液氮保存后再復蘇轉種，田鼠巴貝蟲在小鼠體內還是經歷點狀滋養體、環狀滋養體、長絲狀或阿米巴狀裂殖體、未成熟裂殖子及成熟裂殖子等形態變化，隨著紅細胞被脹大破裂后，裂殖子溢出，再侵入新的紅細胞，重復出芽分裂繁殖。但液氮保存對田鼠巴貝蟲的成活率有一定影響，活體保種在感染后第1 d即可發現少量蟲體，而液氮復蘇1代在感染后3 d才發現蟲體。且復蘇1代達到高峰期的時間會比活體保存的時間要延遲2～3 d，且高峰期的染蟲率存在差異(活體保存為85%，液氮保存為58%左右)。但我們觀察到，當復蘇1代再經小鼠轉種一代后，即恢復了與活體保存相同的存活力。本研究還觀察了保藏時間對田鼠巴貝蟲存活率情況的影響。觀察發現，液氮保存不同月份對田鼠巴貝蟲的存活率影響較小，本研究觀察最長液氮保存時間為9個月，其復蘇1代染蟲率都會稍有降低，但復蘇2代即可恢復原來的水平。但若進行BALB/c小鼠的動物活體保藏，一周需傳代1次，9個月約需傳代40余次，不但耗費了大量的人力物力，還有可能使田鼠巴貝蟲的感染力下降。

近年來對巴貝蟲病越來越重視，對巴貝蟲病診斷、藥物治療及疾病控制等方面的研究越來越多，因此，有一種可長期低溫保存蟲株的方法，對巴貝蟲病的研究有極大的支持作用。本研究通過實驗證實田鼠巴貝蟲的活體保藏和液氮保藏在形態及存活率上變化不大，這樣可以大大節省人力、物力，有效保護了田鼠巴貝蟲的感染力。但是由于國內保存田鼠巴貝蟲標準株的工作開展不久，本研究也僅僅觀察了液氮保存9個月時田鼠巴貝蟲的蟲體狀態和存活力，有關田鼠巴貝蟲低溫保存的機理和關鍵影響因素如保護劑、凍融溫度、冷凍速度等，目前還不清楚，還有待進一步摸索和改進，液氮保存田鼠巴貝蟲的最長時間也需要進一步研究。

[1] Hunfeld KP，Hildebrandt A，Gray JS. Babesiosis: recent insights into an ancient disease[J]. Int J Parasitol，2008，38(11): 1219-1237. DOI: 10.1016/j.ijpara.2008.03.001

[2] Gorenflot A，Moubri K，Precigout E，et al. Human babesiosis[J]. Ann Trop Med Parasitol，1998，92(4): 489-501.

[3] Krause PJ，McKay K，Thompson CA，et al. Disease-specific diagnosis of coinfecting tickborne zoonoses: babesiosis，human granulocytic ehrlichiosis，and Lyme disease[J]. Clin Infect Dis，2002，34(9): 1184-1191. DOI: 10.1086/339813

[4] Vannier E，Krause PJ. Human babesiosis[J]. N Engl J Med，2012，366: 2397-2407. DOI: 10.1056/NEJMra1202018

[5] Homer MJ，Aguilar-Delfin I，Telford SR 3rd，et al. Babesiosis[J]. Clin Microbiol Rev，2000，13(3): 451-469. DOI: 10.1128/CMR.13.3.451-469.2000

[6] Zhao YH，Wang X. A discussion on the change of disease pattern and main health problems in China[J]. Occup and Health，2014，30(21): 3157-3161. (in Chinese)

趙玉紅，王雪.我國現代社會疾病變化及全民健康問題[J]. 職業與健康,2014， 30(21): 3157-3161.

[7] Wang YC，Wei LJ，Liu JT，et al. Comparison and analysis of the incidence and mortality rate of cancer in developed and developing countries[J]. Chin J Clin Oncol，2012，39(10): 679-682. (in Chinese)

王永川，魏麗娟，劉俊田，等.發達與發展中國家癌癥發病率與死亡率的比較分析[J].中國腫瘤臨床，2012,39(10)：679-682.

[8] Lux JZ，Weiss D，Linden JV，et al. Transfusion-associated babesiosis after heart transplant[J]. Emerg Infect Dis，2003，9: 116-119.

[9] Lu Y，Cai YC，Chen SH，et al. Establishment of the experimental animal model ofBabesiamicroti[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis，2012，30(6): 423-427. (in Chinese)

盧艷,蔡玉春,陳韶紅,等.田鼠巴貝蟲實驗動物模型的建立[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2012，30(6)：423-427.

[10] Qu L，Pan WQ. Influence of liquid nitrogen freezing and thawing on survival ofPlasmodiumfalciparumparasite[J]. Acad J Sec Mil Med Univ，2007，28(3): 346-347. (in Chinese)

曲莉，潘衛慶．液氮凍存和復蘇對惡性瘧原蟲存活的影響[J]．第二軍醫大學學報，2007，28(3)：346-347．

[11] Woods DJ，Knauer CS. Discovrey of veterinary antiparasitic agents in the 21st century: a view from industry[J]. Int J Parasitol，2010，40(10): 1177-1181.DOI: 10.1016/j.ijpara.2010.04.005

[12] Gan SB，Li J，Li SG，et al. Observation on ultrastructure of cryoperservedToxoplasma[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis，1989，7(3): 228-229. (in Chinese)

甘紹伯，李紀，栗紹剛,等．弓形蟲低溫冷凍保存后超微結構觀察[J]．中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，1989，7(3)：228-229．

[13] Callow LL，Farrant J. Crypreservation of the promastigote form ofLeishmaniatropicavarmajor at different cooling rates[J]. Int J Parasitol，1973，3(1): 77-78.

Influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability ofBabesiamicrotistandard strain

CAI Yu-chun1,2，CHEN Jia-xu1，LU Yan1，AI Lin1，WU Fen1，CHEN Shao-hong1

(1.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;LaboratoryofParasiteandVectorBiology,MinistryofPublicHealth;WHOCollaboratingCentreforTropicalDiseases,NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,MinistryofScienceandTechnology,Shanghai200025,China；2.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China)

We discussed the influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability ofBabesiamicrotistandard strain.The whole blood of mice infected withBabesiamicrotiwas put in liquid nitrogen to cryopreservation for 1 month，3 months，6 months，9 months，the whole blood was get out respectively and recovery at room temperature，and infected 3 mice respectively，100 μL/ mouse (the first generation after redissolution，the experiment group). In the same time，3 mice were also infected withBabesiamicrotias the animal conservation control group. When the infection rate was at a high level，the whole blood of the experiment group mice were injected into 3 normal BALB/c mice (the second generation after redissolution)，to observe the changes of theBabesiamicrotiform and proliferation situation，and also to observe the infection rate of the first and the second generation after redissolution in different conserving time. Compared withBabesiamicrotiof animal subcultivation，the form ofBabesiamicrotiof liquid nitrogen cryopreservation changed a little. Small trophozoites，annular trophozoites，schizont and immature and mature merozoite and other form can also be seen. Compared withBabesiamicrotiof animal subcultivation，the first time to see the worms and the time attaining to the high infection level were 1 to 2 days later，but for the second generation after redissolution，it is the same. There was no significant difference in different conserving time of 1,3,6,9 months. The influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability and worm form ofBabesiamicrotiis a little，so liquid nitrogen cryopreservation can be a better way to conservingBabesiamicroti.

Babesiamicroti; liquid nitrogen cryopreservation; animal conservation; survive capability

Chen Shao-hong，Email: chensh637@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.002

國家科技基礎條件平臺專項寄生蟲病和熱帶病科技資源中心項目和上海市衛計委青年基金項目(No.20154Y0155)聯合資助(No.2016)

陳韶紅，Email：chensh637@163.com

1.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，世界衛生組織熱帶病合作中心，科技部國家級熱帶病國際聯合中心，衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室，上海 200025；2.復旦大學生命科學學院，上海 200433

R382.3

A

1002-2694(2017)07-0583-05

2016-09-08 編輯：張智芳

Supported by the Tropical Diseases Resource Center Project of National Science and Technology Basic Conditions Platform Program (No.2016) and the Youth Fund of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (No. 20154Y0155)