硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ研究進展

陳家樂,李 杰,鐘衛鴻

(浙江工業大學生物工程學院，浙江 杭州 310032)

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硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ研究進展

陳家樂,李 杰,鐘衛鴻*

(浙江工業大學生物工程學院，浙江 杭州 310032)

肝素/硫酸乙酰肝素是目前臨床運用最廣泛的抗凝血與抗血栓類藥物。硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ(Hs3stⅠ)是肝素/硫酸乙酰肝素酶化學法合成中的關鍵酶，可以催化硫酸基團轉移到葡萄糖胺C3的羥基位置，從而形成重要的抗凝血結構單元。總結了近年來Hs3stⅠ的酶學特性、外源表達以及應用等方面的研究進展。

硫酸乙酰肝素；硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ(Hs3stⅠ)；酶化學法合成

硫酸乙酰肝素(HS)是一類結構復雜的硫酸化線性糖胺聚糖，由葡萄糖胺與糖醛酸組成的二糖重復單元以線性方式延伸形成。肝素是其中特殊的一類。因為其獨特的抗凝血功能，肝素從1935年首次應用于臨床治療，已有80余年的歷史，至今仍然沒有找到其它同功能的類似物。近年來研究發現，肝素還具有抗血脂、抗腫瘤以及抗炎癥等功能[1]。目前藥用級別的肝素主要從豬、牛等家畜的腸粘膜中提取。由于動物來源易受污染，尋找一條更加安全、方便的肝素/硫酸乙酰肝素生產方法勢在必行。

酶化學法是目前體外合成肝素的最具有可行性與研究價值的方法。其利用大腸桿菌的莢膜多糖heparosan作為骨架，經化學方法進行N-脫乙酰/硫酸化，再通過C5異構酶將葡萄糖醛酸異構為艾杜糖醛酸，最后通過硫酸乙酰肝素2-O-、3-O-和6-O-硫酸磺基轉移酶進行硫酸化修飾，從而合成肝素/硫酸乙酰肝素的類似物[2]，如圖1所示。

硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶(Hs3sts)是一類可以催化硫酸基團從硫酸基供體轉移到硫酸乙酰肝素的葡萄糖胺C3羥基位置的酶的統稱，是所有硫酸化修飾中最重要的酶。其中的硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ(Hs3stⅠ)能夠修飾形成具有抗凝血活性的戊糖結構，從而構成肝素/硫酸乙酰肝素最重要的功能之一。作者綜述了Hs3stⅠ的酶學特性、外源表達與應用等3個方面的研究進展。

圖1 肝素/硫酸乙酰肝素的酶化學合成法Fig.1 Chemoenzymatic synthesis of heparin/heparan sulfate

1 Hs3stⅠ的酶學特性

1.1 Hs3sts不同亞型的比較

Hs3sts 3-O位的修飾在完整的硫酸乙酰肝素中的含量并不高，但對其功能有著不可替代的重要作用[3]。

目前，在哺乳動物中發現了7種Hs3sts，主要包括Hs3stⅠ、Hs3stⅡ、Hs3stⅢ(含Hs3stⅢA與Hs3stⅢB)、Hs3stⅣ、Hs3stⅤ與Hs3stⅥ。此外，斑馬魚中也存在Hs3sts。不同的Hs3sts雖然都能轉移硫酸基團到硫酸乙酰肝素的特定位置，但是在基因序列、底物特異性、組織分布等方面存在明顯差異。Liu等[4]根據硫酸磺基轉移酶域的同源性，將這7種亞型分成兩大類。第一類包括Hs3stⅡ、Hs3stⅢ(包括Hs3stⅢA與Hs3stⅢB)、Hs3stⅣ與Hs3stⅥ。這類Hs3sts在硫酸磺基轉移酶域的序列相似性達到了80%以上[5]。此外，這類Hs3sts在功能上也有相似點，即都能催化形成單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)的糖蛋白gD結合位點，因此也被稱為gD型。第二類包括Hs3stⅠ與Hs3stⅤ，它們在硫酸磺基轉移酶域的序列相似性達到了71%[6]。但它們與第一類Hs3sts更大的區別在于都能催化形成有抗凝血功能的硫酸乙酰肝素，使之與抗凝血酶(AT)結合從而發揮抗凝血功能。因此該類型也被稱為AT型[7]。研究表明，Hs3stⅤ既可以催化形成具有抗凝血結構單元的硫酸乙酰肝素，也可以形成HSV-Ⅰ的gD結合位點[8]。然而，相較于Hs3stⅤ，Hs3stⅠ在形成抗凝血結構單元的酶活是前者的250倍[9]。因此，Hs3stⅠ可以作為最主要的Hs3sts在生產肝素/硫酸乙酰肝素的實際應用中發揮作用。

1.2 Hs3stⅠ組織特異性

Shworak等[10]利用帶有不同亞型特異性的探針進行northern分析，發現Hs3sts不同亞型在分布與同一組織中的含量也有差異。其中Hs3stⅠ主要在小鼠的腎臟與大腦中表達，其次為心臟與肺，在肝、胎盤、骨骼肌、胰腺中也有少量表達。值得一提的是，表達Hs3stⅢ的組織與Hs3stⅡ、Hs3stⅣ所在的組織是互補關系，而Hs3stⅠ正好可以涵蓋它們。由此證明Hs3stⅠ存在于更廣泛的組織中，并且在某些組織中，還能與多種Hs3sts共表達，共同行使轉移硫酸基團的作用。

Mochizuki等[11]利用熒光定量測定了人體各組織中Hs3sts的表達量，發現Hs3stⅠ在小腦中的表達量非常高，遠超過其它組織。因此，猜測Hs3stⅠ可能在腦組織中發揮一些未知的特殊功能。Yabe等[12]通過研究小鼠在不同時期內大腦中Hs3sts的表達量，發現Hs3sts的表達不僅受空間也受時間的控制。他認為，包括Hs3stⅠ在內，不同功能的Hs3sts修飾形成了多種不同結構的硫酸乙酰肝素，而這些硫酸乙酰肝素具有多種生物學活性，對于小鼠大腦的神經發育、分化的不同階段起到非常重要的作用。然而，到目前為止，很少有學者針對不同生物與組織來源的Hs3stⅠ的產物及功能進行差異性分析[3]。

1.3 Hs3stⅠ底物特異性與結構分析

研究發現，硫酸乙酰肝素無論是在生物體內合成[13]，還是在體外酶法或酶化學法[14]合成中，Hs3stⅠ通常都是在硫酸乙酰肝素合成的最后一步發揮作用，一種可能的假設是，該酶存在比較高的底物特異性。雖然Hs3sts都能轉移硫酸基團到葡萄糖胺的3-OH位置，但在底物的選擇性方面，不同的亞型存在一定區別。一般來說，Hs3stⅠ優先修飾的目標是葡萄糖胺，其非還原端的葡萄糖醛酸并未進行2-O-硫酸化[15-16]。Hs3stⅡ、Hs3stⅢ、Hs3stⅣ、Hs3stⅥ優先修飾葡萄糖胺，其非還原端為經過2-O-硫酸化修飾的艾杜糖醛酸[17-18]。而Hs3stⅤ的作用與是否經2-O-硫酸化修飾無關。因此Hs3stⅤ具有AT與gD兩種修飾形式[19]。

圖2 Hs3stⅠ晶體結構的立體條帶狀圖Fig.2 Stereo ribbon diagram of the crystal structure of Hs3stⅠ

圖3 Hs3stⅠ催化硫酸乙酰肝素進行3-O-硫酸化的作用機理Fig.3 Action mechanism of 3-O-sulfonation of HS catalyzed by Hs3stⅠ

2 Hs3stⅠ的外源表達

Myette等[22]對人類來源的Hs3stⅠ進行信號肽切除后轉移至大腸桿菌中進行誘導表達，從而獲得可溶性的Hs3stⅠ蛋白。此外，他們還將誘導表達得到的Hs3st Ⅰ蛋白與從被桿狀病毒感染的SF9細胞中提取的重組Hs3stⅠ蛋白進行比較，發現兩者在硫酸化修飾乙酰肝素的過程和程度都很相似。Edavettal等[20]對小鼠來源的Hs3stⅠ基因的催化中心G48 到H311在大腸桿菌中進行了外源表達。只對催化中心進行表達不僅是因為該片段是Hs3stⅠ發揮作用的區域，也是因為該區域比全長更親水。Wang等[23]將小鼠來源的Hs3stⅠ基因片段導入枯草芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌中進行外源表達。將外源基因導入芽孢桿菌而不是大腸桿菌，可以降低重組蛋白中的內毒素含量，使其更好地運用于臨床藥物的生產。經測定，在芽孢桿菌中表達的蛋白中內毒素含量比大腸桿菌來源的蛋白要低104～105數量級。同時還發現，Hs3stⅠ在芽孢桿菌中進行外源表達時產生了包涵體，只有少部分的目的蛋白以可溶形式存在。由于實驗中只收集其中的可溶性成分進行后續研究，使得酶得率大大降低。

Hajmohammadi等[24]測定了小鼠不同組織中Hs3stⅠ的酶活，發現大腦中的酶活最高，達到了0.07 U·μL-1，肺與血漿中的酶活稍低，約為0.03 U·μL-1。大腦中Hs3stⅠ的高酶活表明其在大腦中可能發揮更為重要的作用，這與Mochizuki等[11]和Yabe等[12]的推測不謀而合。王華[25]對在大腸桿菌中進行外源表達獲得的Hs3stⅠ進行了酶活測定，確定其酶活高達5.29 U，比酶活為0.75 U·mg-1。田倩[26]也用類似的方法對Hs3stⅠ進行了酶活測定。但酶活低于王華的，為4.5 U，但是由于重組酶的純度更高，使得比酶活高于王華的，達到了1.02 U·mg-1。Wang等[23]也測定了在芽孢桿菌中獲得的重組Hs3st Ⅰ的酶活，雖然內毒素含量較低，但比酶活較低，只有0.3 U·mg-1。

3 Hs3stⅠ的應用

3.1 Hs3stⅠ在肝素/硫酸乙酰肝素合成中的作用

肝素/硫酸乙酰肝素的抗凝血作用主要來自其結構中特定的戊糖序列：-GlcNS(Ac)6S-GlcUA-GlcNS3S(±6S)-IdoUA2S-GlcNS6S-。該結構可以通過賴氨酸殘基與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)結合，從而提高后者對凝血因子的抑制作用。戊糖序列的合成需要多種功能酶進行修飾，而其中最重要的就是Hs3stⅠ介導的3-O-硫酸化的修飾。研究表明，3-O位置每增加一個硫酸基團，都將顯著提高肝素/硫酸乙酰肝素的抗凝血能力[8]。Zhang等[27]在對小鼠的研究中發現，幾乎所有抗凝血結構的產生都由Hs3stⅠ負責。因此，Hs3stⅠ通常被認為是抗凝血活性肝素/硫酸乙酰肝素生產中的關鍵酶。如何提高Hs3stⅠ的產量與酶活，也是肝素/硫酸乙酰肝素酶化學法合成中面臨的重要問題。

值得注意的是，有學者發現，一些血栓病人體內的肝素與抗凝血酶結合位點的氨基酸發生了突變。因此，Dewerchin等[28]利用定點突變構造敲除小鼠抗凝血酶結合位點，研究這些氨基酸缺失對機體的影響。然而在敲除小鼠中，發現除了含AT結合位點的肝素數量銳減以外，并沒有出現血栓。這其中的機理尚不清楚，可能的解釋是其它Hs3sts代替Hs3stⅠ發揮了作用，或是未經3-O修飾的肝素發揮了抗凝血活性。

3.2 Hs3stⅠ的其它生物學功能

研究發現，Hs3stⅠ除了眾所周知的通過硫酸化修飾產生抗凝血結構外，還有許多其它生物學功能。Hs3stⅠ可以與Hs3stⅢ共同修飾硫酸乙酰肝素，修飾產物可以與病毒糖蛋白gD結合，從而抑制其與細胞表面硫酸乙酰肝素結合，達到阻斷病毒對細胞感染的功能[29]。

此外，Hs3stⅠ的許多功能尚未被廣泛且深入地研究。如敲除了Hs3stⅠ的小鼠表現出出生后高死亡率的特征，還伴隨對脂多糖介導的炎癥非常敏感、胎兒宮內發育遲緩、自發的眼退化等癥狀[24]。然而其作用機理卻尚未被闡明。

4 結語

隨著從動物體中提取肝素的安全問題日益凸顯，利用酶化學法合成肝素越來越受到人們重視。該方法相比于其它方法更為安全、環保、低成本。其中合成過程中的關鍵酶Hs3stⅠ能夠催化形成具有抗凝血活性的戊糖結構。此外，經Hs3stⅠ修飾后的底物還具有抗病毒感染、抗炎癥反應[30]、抗腫瘤[31]等多種功能。可以說，Hs3stⅠ具有廣泛的研究與應用前景。

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Research Progress in Heparan Sulfate 3-O-Sulfotransferase Ⅰ

CHEN Jia-le，LI Jie，ZHONG Wei-hong*

(CollegeofBiologicalEngineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310032，China)

Heparin/heparan sulfate is the most widely-used anticoagulant and antithrombotic drugs.Heparan sulfate 3-O-sulfotransferaseⅠ(Hs3stⅠ) is a key enzyme in the chemoenzymatic synthesis of heparin/heparan sulfate,which can catalyze the transfer of sulfate group to the hydroxyl group of glucosamine C3,thus forming an important anticoagulant unit.We summarized the research progress of enzymatic characteristics,exogenous expression,and application of Hs3stⅠin recent years.

heparan sulfate；heparan sulfate 3-O-sulfotransferaseⅠ(Hs3stⅠ)；chemoenzymatic synthesis

國家自然科學基金項目(21076195)，高等學校博士學科點專項科研基金項目(2011331711004)，浙江省科技廳國際合作項目(2011C24007)

2017-03-01

陳家樂(1992-)，女，浙江金華人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：chenjiale326@163.com；通訊作者：鐘衛鴻，教授，博士生導師，E-mail：whzhong@zjut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.001

Q93

A

1672-5425(2017)07-0001-05

陳家樂,李杰,鐘衛鴻.硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基轉移酶Ⅰ研究進展[J].化學與生物工程，2017，34(7)：1-5.