采用羅氏培養基進行MTB藥物敏感性試驗的影響因素分析

姜廣路 戴廣明 黃海榮

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·論著·

采用羅氏培養基進行MTB藥物敏感性試驗的影響因素分析

姜廣路 戴廣明 黃海榮

目的 評價基于羅氏培養基絕對濃度法的結核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測異煙肼、利福平、乙胺丁醇的藥物濃度標準，以及不同接種菌量、接種方式對耐藥性檢測結果的影響。方法 按照世界衛生組織推薦方法從可能敏感患者和可能耐藥患者痰液樣本中的分離菌株，分別測定兩類菌株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇的最低抑菌濃度(MIC)并計算累計百分比，以兩類菌株累計百分比差值最大的MIC確定耐藥界限；分別將菌量為10-3mg和10-4mg的結核分枝桿菌，接種于比例法耐藥界限的3種藥物含藥培養基，經4周孵育后比較耐藥結果；比較接種量均為10-6mg菌量的兩種接種方法(接種環和滴管接種)孵育4周后菌落形成單位(CFU)的數量差異。 結果 異煙肼、利福平和乙胺丁醇經絕對濃度法測定的濃度界限分別為0.2 μg/ml、40 μg/ml、2 μg/ml；不同接種量(10-3mg與10-4mg)接種相同含藥培養基，其藥敏試驗結果差異無統計學意義(χ2值分別為0.57、0.00、0.00，P值分別為0.45、1.00、1.00)；使用接種環接種菌懸液的菌落形成單位數[(40.60±34.54)個，95%CI=35.08～46.12個]明顯多于使用滴管的菌落形成單位數[(11.27±11.11)個，95%CI=9.50～13.05個](t=11.58，P<0.01)。 結論 異煙肼、利福平、乙胺丁醇的耐藥界限采用比例法藥物濃度界限更適宜；接種菌量10-3mg和10-4mg對藥敏試驗結果無明顯影響；接種環接種效果較滴管接種效果好。

分枝桿菌, 結核； 微生物敏感性試驗； 培養基, 無血清； 診斷技術和方法； 結果與過程評價(衛生保健)； 因素分析, 統計學

耐藥結核病是全球關注的嚴重公共衛生問題。據世界衛生組織(WHO)2016年結核病疫情報告估算，全球結核病疫情較以往估算更為嚴重。耐多藥結核病(MDR-TB)患者絕對數最多的前3個國家分別是印度、中國、俄羅斯聯邦[1-2]，耐藥結核病仍是結核病控制的重大挑戰之一。高質量的結核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，對耐藥結核病的控制至關重要。綜合考慮成本和可操作性等諸多因素，基于羅氏培養基的傳統藥敏試驗短期內仍不能被完全替代。目前我國的結核病細菌學檢測指南、檢驗規程將絕對濃度法和比例法同時作為標準方法[3-4]，但在實際工作中，這兩種方法的耐藥檢測結果有一定差異，曾經有學者對兩種方法的接種菌量、細菌菌懸液的制備、出現差異的菌株最低抑菌濃度(MIC)等方面進行了研究[5-9]，各個研究的結論不盡相同[10-11]；尤其對于兩種方法耐藥結果不一致時，如何確定結果的問題仍沒有明確解決。本研究基于對結核分枝桿菌耐藥檢測指南發展歷程的回顧[12-13]，按照世界衛生組織(WHO)[14]及其他文獻推薦的方法[15]，根據兩種方法的不同之處，及患者抗結核藥物治療史選取符合研究目的的結核分枝桿菌菌株，測定異煙肼、利福平、乙胺丁醇的絕對濃度法耐藥濃度界限,并對接種量和接種方式(接種環接種和吸管滴加)等因素進行分析, 以期為結束兩種方法并行，形成統一的檢測方法和標準提供參考。

材料和方法

一、材料

1.菌株：依據研究目的不同，選取不同來源的菌株。所有結核分枝桿菌臨床分離株均經過對硝基苯甲酸鑒別培養基(PNB)鑒定為結核分枝桿菌復合群。(1)測定耐藥濃度界限的菌株：①可能敏感的結核分枝桿菌菌株(PS)。來自2007年全國結核病耐藥基線調查時未進行抗結核藥物治療的新登記肺結核患者的分離菌株，共100株。②可能耐藥的結核分枝桿菌菌株(PR)。來自中國全球基金耐藥結核病控制項目湖北肺結核治療失敗患者分離株，以及北京胸科醫院肺結核患者經異煙肼、利福平、乙胺丁醇治療不少于6個月的臨床分離株，共計對異煙肼、利福平的可能耐藥菌株各100株，對乙胺丁醇的可能耐藥菌株73株。可能敏感的結核分枝桿菌菌株和可能耐藥的結核分枝桿菌菌株用于藥敏試驗含藥培養基濃度標準測定，菌株數量符合WHO規定[14]的可能敏感的菌株不少于100株，可能耐藥的菌株不少于50株的規定。(2)用于藥敏試驗接種菌量的研究菌株：來自2007年全國結核病耐藥基線調查菌株515株，用于藥敏試驗接種菌量的研究菌株。(3)用于藥敏試驗接種方法研究的菌株：北京胸科醫院肺結核患者分離株160株。(4)結核分枝桿菌標準株：H37Rv(ATCC27294)，來自國家結核病參比實驗室。

2.抗結核藥物：藥物純粉來自Sigma公司，異煙肼批號為115K0675，乙胺丁醇批號為28H1266，利福平批號為058K1405。

3.培養基：參照《結核病診斷細菌學檢驗規程》[16]規定配制空白羅氏培養基和相應濃度含藥羅氏培養基。

4. 22SWG標準接種環：一環接種液體體積約10 μl[4]，由國家結核病參比實驗室提供。

5.耐藥性分子檢測試劑：結核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒(實時熒光PCR法，Cepheid 公司生產；批次：1000039249)。結核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法，廈門致善生物科技股份有限公司出品；批號：17010301)。

二、研究方法

1.絕對濃度法藥敏試驗耐藥界限測定：綜合現行的比例法和絕對濃度法藥敏試驗方法的濃度界限，制備一系列不同濃度的含藥培養基，以測定藥物的MIC。異煙肼終濃度分別為：0.05、0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/ml；利福平終濃度分別為5、10、20、40、80、100、200、250 μg/ml；乙胺丁醇終濃度為0.25、0.5、1、2、3、4、5 μg/ml。

2.菌懸液制備及接種：將試驗菌株轉種至空白羅氏培養基，36～37 ℃培養至約3～4周，制備1麥氏濁度(相當于1 mg/ml菌懸液濁度)的菌懸液，經2次10倍稀釋成10-2mg/ml，以滴管取0.1 ml分別滴加至空白培養基和含藥培養基，在36～37 ℃下進行孵育，孵育4周后報告結果。在對照培養基上細菌生長旺盛的前提下，以抑制99%結核分枝桿菌生長的最低藥物濃度作為該試驗的菌株MIC。

3.耐藥界限確定：分別統計可能敏感菌和可能耐藥菌的MIC累計百分比，將累計百分比之差(可能敏感菌和可能耐藥菌累計百分比相減的差值)最大的MIC確定為耐藥濃度界限。

4.耐藥驗證：取利福平40 μg/ml

5.兩種檢測方法不同接種量標準檢測耐藥性比較：比較含藥培養基藥物濃度相同而接種量不同的藥敏試驗結果。按照比例法標準制備的異煙肼(0.2 μg/ml)、乙胺丁醇(2 μg/ml)、利福平(40 μg/ml)含藥培養基。取2007年全國結核病耐藥性基線調查的結核分枝桿菌菌株515株，按照目前國內規程絕對濃度法接種量[制備1麥氏濁度(1 mg/ml)的菌懸液，逐步10倍稀釋制備成10-2mg/ml]，以滴管滴加0.1 ml接種于空白培養基和含藥培養基上，經36～37 ℃孵育，4周后報告結果；同時按照比例法藥敏試驗方法[接種菌量(10-2mg/ml)]操作，以接種環的方式接種0.01 ml測定該細菌的耐藥性，將兩種方法的結果相比較，結果采用配對資料McNemar 檢驗。

6.接種方式比較：比較接種量均為10-6mg菌量的兩種接種方法菌落生成單位(CFU)的數量差異。臨床分離結核分枝桿菌菌株160株，制備1麥氏濁度的菌懸液，逐步10倍稀釋為10-4mg/ml和10-5mg/ml濃度的菌懸液，使用微量移液器取10-4mg/ml 菌懸液10 μl，接種至2支羅氏培養基后，再以接種環劃線涂勻；另取2支羅氏培養基，使用無菌吸管吸取10-5mg/ml菌懸液滴加0.1 ml至羅氏培養基，置于斜面架上，保持培養基斜面水平；將以上兩種接種方式接種的培養基置于同一恒溫培養箱孵育。經36～37 ℃孵育4周后觀察菌落生成數量的差異。

三、統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計學數據分析，兩種檢測方法不同藥物濃度在相同培養基上檢測的耐藥性比較采用配對資料McNemar檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.藥敏試驗在相同含藥培養基的濃度界限測定：異煙肼、利福平、乙胺丁醇的MIC測定結果分別為：異煙肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml、乙胺丁醇2 μg/ml。詳見表1～3。檢測結果與絕對藥物法的MIC標準相同。

表1 異煙肼最低抑菌濃度分布

注 MIC累計百分比為(該濃度菌株數+以上所有濃度菌株數)/菌株總數；MIC累計百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計百分比相減的差值；“-”表示本研究對低于0.05 μg/ml或高于16 μg/ml的 MIC檢測濃度未進行檢測，故未計算差值

表2 利福平最低抑菌濃度分布

注 MIC累計百分比為(該濃度菌株數+以上所有濃度菌株數)/菌株總數；MIC累計百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計百分比相減的差值；“-”表示本研究對低于5 μg/ml或高于250 μg/ml的MIC檢測濃度未進行檢測，故未計算差值

表3 乙胺丁醇最低抑菌濃度分布

注 MIC累計百分比為(該濃度菌株數+以上所有濃度菌株數)/菌株總數；MIC累計百分比之差為可能敏感菌和可能耐藥菌累計百分比相減的差值；“-”表示本研究對低于0.25 μg/ml或高于5 μg/ml的 MIC檢測濃度未進行檢測，故未計算差值

2.耐藥基因突變驗證結果：利福平40 μg/ml

3.不同接種量結果比較：本研究僅對絕對濃度法和比例法的差異是否有統計學意義進行統計學處理，采用配對資料McNemar檢驗，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表4)。

4. 不同接種方法菌落計數：因菌落融合不能計數等原因，160對已接種細菌的羅氏培養基中，可統計菌落數量的培養基為153對。滴管接種法菌落均數為(11.27±11.11)個 (95%CI：9.50～13.05個)，劃線接種法菌落均數為(40.60±34.54)個(95%CI：35.08～46.12個)，兩種接種方法菌落生成單位數量差異有統計學意義(t=11.58，P<0.01)。

討 論

一、異煙肼、利福平和乙胺丁醇絕對濃度法藥敏試驗含藥培養基濃度標準界定

(一)國外絕對濃度法和比例法發展概述

1963年WHO公報提出結核分枝桿菌藥敏試驗方法，包括Gertrud Meissner提出的絕對濃度法和Canetii提出的比例法[17]。絕對濃度法檢測的藥物包括異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸，其中異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml，含藥羅氏培養基制備時僅凝固1次，制備1麥氏濁度的菌懸液，稀釋50倍，以10 μl接種環分別接種于空白培養基和含藥培養基各1環，接種菌量為2×10-4mg，約為2000～10 000個細菌。待結果報告時，含藥培養基生長菌落超過20個為耐藥，判讀標準實質是耐藥菌數量超過全部菌最低數量的1%即為耐藥。Canetti等提出的比例法，檢測藥物包括異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸，其中異煙肼濃度為0.2 μg/ml和1 μg/ml，制備10-3mg/ml和10-5mg/ml菌懸液，分別取0.2 ml接種至空白培養基和含藥培養基，至結果報告時，含藥培養基菌落數≥1%即為耐藥。由此可見，絕對濃度法與比例法創始之初，兩種方法理論基礎相同，耐藥臨界濃度和接種量均相同或相近。這些方法實踐基礎與1963年在東部非洲醫院的結核病患者異煙肼治療與實驗室結果比對的研究[17]有密切的關系，其研究發現患者治療后培養陰轉情況與耐受0.2 μg/ml異煙肼的結核分枝桿菌所占的比率相關性最好，而與耐受1 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml的所占比率相關性很差；特別值得注意的是，文獻[17]著重說明，療效與結核分枝桿菌的MIC無明顯的相關性。

至1969年，WHO公報中進一步明確異煙肼濃度為0.2 μg/ml，利福平為40 μg/ml，乙胺丁醇為2 μg/ml[14]，并規定了結核分枝桿菌藥敏試驗耐藥濃度界限的方法，其規定為選取可能敏感的菌株不少于100株，可能耐藥的菌株不少于50株，對這些菌株進行MIC測定并統計累計百分比，將累計百分比差別最大的最低抑菌濃度作為耐藥界限。1997年World Health Organization與International Union Against Tuberculosis and Lung Disease[19]公布的Globalworkinggrouponantituberculosisdrugresistancesurveillance1guidelineforsurveillanceofdrugresistanceintuberculosis中提及的藥敏試驗方法及其耐藥濃度界限仍保持與1963年、1969年WHO公報的耐藥界限一致。

(二)國內絕對濃度法發展概述

我國最初的結核病細菌學檢驗規程規定的藥敏試驗方法在1963年頒布[20]。其方法規定羅氏培養基制備時需凝固2次，檢測藥物包括異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸，異煙肼濃度分別為0.1、1、10 μg/ml，接種量為0.1 mg，即相當于1麥氏濁度的菌懸液0.1 ml分別接種至空白培養基和含藥培養基上；含藥培養基菌落少于10個菌落不報告，需重復試驗；大于10個則記錄該濃度并報告該濃度，該方法重點強調耐藥標準待與臨床結果比對后再確定；由此可知，國內絕對濃度法創立最初其實質是簡化的MIC測定，并沒有規定耐藥標準。1963—1980年諸多學者對結核分枝桿菌藥敏試驗進行了研究[21-23]，但耐藥菌株均分離自臨床治療過的患者，并未嚴格來自治療失敗或治療6個月以上的結核病患者；制備羅氏培養基時仍然凝固2次。1980年《抗結核藥物耐藥性測定暫行規定》頒布[24]，含藥培養基中濃度分別為異煙肼1 μg/ml和10 μg/ml、乙胺丁醇5 μg/ml和50 μg/ml，以及利福平5、10和250 μg/ml，羅氏培養基制備時需凝固2次。在1996年刊登在《中國防癆雜志》的《結核病診斷細菌學檢驗規程》[16]中，將羅氏培養基凝固次數由2次改為1次，但藥物濃度并未進行相應調整。2006年出版的《結核病診斷實驗室檢驗規程》同時將比例法和絕對濃度法列出[3]，絕對濃度法中鏈霉素不再使用加倍量。基于以上發展歷程，國內的絕對濃度法與世界衛生組織公告中報道的絕對濃度法、比例法均不相同，在培養基制備過程、接種步驟、結果判讀等方面有很大差異，必然導致檢測結果存在差異。

(三)國內學者對兩種方法的比較研究

丁北川等[7]按照WHO規定的絕對濃度法進行藥敏試驗，結果與比例法差異無統計學意義。劉宇紅等[10]研究表明，比例法和國內絕對濃度法結果差異有統計學意義的藥物是異煙肼、乙胺丁醇，而濃度界限接近的利福平則差異無統計學意義，有差異的菌株MIC均在比例法和絕對濃度法濃度界限之間。也說明了兩種藥敏方法結果有差異的主要原因是耐藥界限。劉宇紅等[11]采用2000年全國結核病流行病學抽樣調查分離的結核分枝桿菌菌株進行兩種方法的檢測比較，結果顯示異煙肼和利福平差異無統計學意義，乙胺丁醇差異有統計學意義；也提示了諸多學者的研究結果比較不盡相同的原因，即在研究的所有結核分枝桿菌菌株中，兩種方法檢測的結核分枝桿菌菌株MIC介于比例法和國內絕對濃度法耐藥界限之間的構成比率的差異有統計學意義。因此，不嚴格界定患者的用藥史，難以獲得穩定的比較結果，也難以確定耐藥濃度界限。

(四)本研究測定的耐藥界限及討論

本研究根據WHO規定，嚴格依據治療史納入試驗菌株(可能敏感菌株來自未治療的患者，可能耐藥菌株來自治療失敗的患者)，且樣本量不少于WHO規定標準。結果顯示異煙肼、利福平、乙胺丁醇的羅氏培養基耐藥界限與比例法耐藥界限一致，經檢測對利福平和異煙肼耐藥基因突變的結核分枝桿菌，其MIC介于比例法和國內絕對濃度法耐藥界限之間，多數明確存在與表型耐藥相關的耐藥基因突變。

雖然近年很多學者對耐藥結核病影響因素進行了大量研究，有學者提出傳播是結核分枝桿菌耐藥的主要原因[25]，這種結論是將初治和復治耐藥菌株合并分析所得的結果，更傾向于耐藥流行的影響因素研究。而本研究根據治療史將菌株進行分類并測定MIC，是基于結核分枝桿菌耐藥的產生原因進行分析。也有學者基于2007年全國結核病耐藥基線調查，將初治和復治患者分別分析，認為初治患者接受過小于1個月的治療，以及復治患者接受多次治療是耐藥的危險因素[26-27]，說明結核病經過抗結核藥物治療，尤其是多次治療是耐藥產生的影響因素。

國內沿用絕對濃度法作為診斷和治療參考由來已久，尤其習慣于絕對濃度法設立高低兩個濃度，可以得到低濃度耐藥和高濃度耐藥結果，甚至在可選藥物很少的情況下，低濃度耐藥可為繼續使用該藥物提供某種程度的實驗室“參考”依據。但需要注意的是，根據現有的WHO指南，同一種藥物，通過調整劑量作為某種程度的“新藥”使用的只有異煙肼，而且不是推薦的優先選擇。其理論基礎是結核分枝桿菌不同的異煙肼基因突變導致異煙肼耐藥程度的不同，inhA基因突變可耐受0.2 μg/ml的異煙肼，katG基因突變導致結核分枝桿菌耐受1 μg/ml的異煙肼[28]。而國內的絕對濃度法測定的異煙肼濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml，因此國內的絕對濃度法低濃度耐藥難以作為繼續使用異煙肼的實驗室依據。另外，近年來，高劑量利福平臨床實驗較多，其目的是在藥物不良反應增加不明顯的前提下，將利福平用量從10 mg/kg提高至15 mg/kg甚至20 mg/kg，從而提高初治結核病患者的治愈率[29-31]。這種方法是將利福平作為一種藥物一種劑量使用，并非依據結核分枝桿菌對利福平不同耐藥程度選擇不同劑量。本研究雖然設定單一濃度界限，但并不反對從科研角度研究其他濃度界限和不同突變位點的關系[32]，但如上文1963年針對結核病患者異煙肼治療結果的研究報道，耐藥程度(實驗室具體表現為MIC)與療效無明顯相關性[18]。針對臨床治療而言，確定單一的耐藥界限后，進而關注超過這一界限的結核分枝桿菌菌株的比率，可能對治療有更多參考價值。

耐藥菌的定義包含了耐藥菌的兩個關鍵屬性[16,33]，即臨床治療反應性下降和明顯不同于接觸過藥物的野生菌株，其發現過程為在臨床治療中發現療效下降的菌株，經實驗室檢測發現與未用過藥物菌株的差異，通過實驗室檢測這種差異從而為臨床治療提供參考。提示耐藥菌與敏感菌的臨床療效和實驗室檢測結果明顯不同，有必要定期對治療失敗和未治療的患者菌株進行實驗室檢測分析，因為經過長期的治療，這種源自臨床的耐藥界限可能存在一定程度的變化；如果結核病控制比較好，未治療患者的耐藥率可能會降低，反之則升高，這兩種狀況均會影響耐藥濃度界限的確定。

此外，雖然本研究的結果表明培養基藥物濃度界限與比例法測定相同，但數據表明利福平30 μg/ml和40 μg/ml差別很小。Laszlo等[34]在1997年發表的第1次全球結核病網絡實驗室結核分枝桿菌藥敏試驗實驗室間的質量評價，曾提出利福平在30 μg/ml和40 μg/ml可能差異無統計學意義。采用德國標準(DIN)方案的測試結果有望證實這一結果，其利福平的臨界濃度是32 μg/ml。

有學者對耐藥的定義提出了質疑，即質疑傳統表型藥敏試驗結果不能完全與臨床治療結果一致，認為將復雜的臨床療效歸因于細菌耐藥存在一定局限，忽略了人體藥物代謝和免疫作用的因素[33]。同時Gumbo[35]根據藥代動力學和藥效學提出藥敏試驗的臨界濃度應進一步降低。但就目前研究狀況而言，難以將細菌抗藥性、藥物代謝、人體免疫狀況等因素進行整合后再全面評價臨床療效。僅通過細菌學方法進行的耐藥性檢測也僅僅可以檢測細菌的屬性，故目前當務之急是規范和標準化藥敏試驗，以便將來整合其他影響因素來評價療效。

二、接種量對結果的影響

研究結果顯示，藥物濃度界限采用比例法但接種量采用絕對濃度法的細菌量(菌液質量濃度10-2mg/ml，接種0.1 ml，接種量為10-3mg)，其藥敏試驗結果與標準比例法的結果(菌液質量濃度10-2mg/ml，接種0.01 ml，接種菌量為10-4mg)差異無統計學意義，與黎友倫等[8]的研究結果相同。其原因可能是無論哪一種接種菌量(1 mg濕菌細菌數量相當于107數量級,10-3mg、10-4mg的細菌數量分別為104、103)，均遠低于耐藥自然突變率(結核分枝桿菌的異煙肼、利福平、乙胺丁醇自然突變率為每106、108、105個細菌檢出一個自然耐藥突變)，提示接種量對兩種接種方法藥敏試驗結果無明顯影響。

三、接種方式的差異

本研究結果提示，使用接種環以涂抹方式接種(劃線接種法)的菌落數明顯多于滴管法，原因可能是使用滴管滴加方式可使一次滴加菌液較多(0.1 ml 或100 μl)，盡管保持培養基斜面水平放置，但由于結核分枝桿菌表面脂質較多，疏水性較強，在菌懸液中結核分枝桿菌更易聚集而不易分開，導致生成的菌落數較少；而經接種環取少量菌懸液(10 μl)劃線接種，液體成分較少，經接種環劃線后，結核分枝桿菌直接與培養基斜面接觸，不易再聚集，故菌落較多。

本研究結果顯示，雖然滴管接種法菌落均數的標準差[(11.27±11.11)個]較小，但根據95%CI絕大多數滴管法的菌落在9.50～13.05個之間，而絕大多數劃線接種法菌落數在35.08～46.12個之間；故可認為在多數情況下，針對同一菌懸液，使用劃線接種較滴管法接種效果好。

綜上，比例法和絕對濃度法是基于MIC的藥敏試驗方法，兩種方法僅在接種方法和判讀方式等方面有所不同，不宜將這兩種方法對立看待，絕對濃度法可以看作是在接種量精確定量前提下的比例法。比例法從理論的角度相對嚴謹，絕對濃度法在操作方面相對簡易，只需將目前國內《結核病細菌學檢驗規程》中絕對濃度法的藥物耐藥界限調整為與比例法藥物濃度界限一致, 則無論采用哪種方法檢測耐藥性，其結果均具有較高的一致性和可比性，有助于解決某些菌株檢測結果不一致的問題。此外，使用接種環以涂抹方式接種菌液，較滴管法能獲得相對較多的菌落數，有助于進行菌落計數。已有學者對其他影響因素(如含藥培養基中藥物含量及保存時間等)進行了研究，總體結論是含藥培養基中藥物處于持續衰減狀態，含藥培養基保存不要超過1個月[36-38]，其結論與目前國內外的相關指南[3-4]基本一致。關于測定其他抗結核藥物的濃度界限及影響因素還有待進一步研究。

志謝 湖北省疾病預防控制中心傳染病防治研究所李國明及周麗平兩位老師給予了本研究傾力幫助和支持。

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(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Analysis on influencing factors ofMycobacteriumtuberculosisdrug susceptibility test by using L?wenstein Jensen medium

JIANGGuang-lu,DAIGuang-ming,HUANGHai-rong.

TuberculosisClinicalLaboratoryofBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

HUANGHai-rong,Email:huanghairong@tb123.org

Objective To evaluate the drug concentration criteria of drug susceptibility test (DST) ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) to isoniazid, rifampicin, ethambutol by using absolute concentration method based on Lowenstein-Jensen media, and to evaluate the effects on DST results when different inoculums and inoculation me-thods were adopted. Methods According to the methods recommended by World Health Organization (WHO), the MTB strains were isolated from the sputum specimens collected from the TB patient who were likely drug susceptible cases and likely drug resistant cases respectively, and then the minimal inhabitation concentration (MIC) of isoniazid, rifampicin, ethambutol to the two kinds of MTB strains were tested. The cumulative percentage of the two kinds of MTB strains were calculated and the MIC of which the greatest difference of cumulative percentage between the two kinds of MTB strains was regarded as the cut-off value of drug resistance. 10-3mg and 10-4mg MTB were inoculated on the drug contained media with isoniazid, rifampicin and ethambutol respectively and their drug-resis-tance cut-off values were the criteria of proportion method. The drug resistance results were compared after 4 weeks incubation; MTB suspicion were inoculated on Lowenstein-Jensen with loop or pipette respectively (inoculums were both 10-6mg), colony-forming units (CFU) were compared after four weeks incubation. Results The concentration cut-off values of isonazid, rafampicin and ethambutol tested by absolute concentration method were 0.2 μg/ml, 40 μg/ml and 2 μg/ml respectively. The DST results showed no statistically significant difference between the dif-ferent inoculums (10-3mg vs. 10-4mg)(χ2was 0.57, 0.00, 0.00;Pvalue was 0.45, 1.00, 1.00 respectively). The number of CFU inoculated with loop (40.60±34.54, 95%CI=35.08-46.12) was significantly higher than the number of CFU inoculated with pipette (11.27±11.11, 95%CI=9.50-13.05) (t=11.58,P<0.01). Conclusion The drug resistance cut-off values of isonazid, rifampicin and ethambutol tested by the proportion method are more reasonable. There is no obvious difference between the DST results with the inoculums of 10-3mg and 10-4mg. It is better to inoculate with loop than with pipette.

Mycobacteriumtuberculosis; Microbial sensitivity tests; Culture media, serum-free; Diagnostic techniques and methods; Outcome and process assessment (health care); Factor analysis, statistics

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.007

北京市醫院管理局“登峰”計劃專項經費資助(DFL20151501)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院結核病臨床實驗室

黃海榮，Email：huanghairong@tbl23.org

2017-05-13)