黃芩素誘導乳腺癌細胞自噬*

凌 云， 屠 玨， 蔡兆偉， 蔡月琴， 褚燕青， 陳民利

(浙江中醫藥大學 1動物實驗研究中心， 2比較醫學研究所， 浙江 杭州 310053)

黃芩素誘導乳腺癌細胞自噬*

凌 云1, 2△， 屠 玨1, 2， 蔡兆偉1, 2， 蔡月琴1, 2， 褚燕青1， 陳民利1, 2

(浙江中醫藥大學1動物實驗研究中心，2比較醫學研究所， 浙江 杭州 310053)

目的： 考察黃芩素誘導乳腺癌細胞的自噬作用，并初步探討其機制。方法: 采用MTT實驗考察黃芩素對乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞活力的影響，確定給藥劑量。Western blot檢測黃芩素(25、50和100 μmol/L)及聯合自噬抑制劑3-MA作用下，MCF-7細胞和4T1細胞中自噬特征蛋白LC3-II和LC3-I的表達水平，流式細胞術Annexin V/PI雙染法觀察3-MA對黃芩素誘導MCF-7細胞和4T1細胞凋亡的影響，確認黃芩素誘導自噬的作用。通過Western blot考察自噬信號通路相關蛋白p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT的蛋白水平，結合AKT-mTOR激活劑EGF明確AKT-mTOR通路在黃芩素誘導乳腺癌自噬中的作用。結果: 50 μmol/L及其以上劑量的黃芩素可顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞的活力，其作用具有顯著的時效和量效性。Western blot結果表明，50和100 μmol/L黃芩素作用下MCF-7細胞和4T1細胞的LC3-II/LC3-I比例顯著增強，3-MA加入后又明顯降低。流式細胞術結果顯示，相比黃芩素單用組，聯合自噬抑制劑可促進MCF-7細胞的壞死和凋亡。通路蛋白研究表明mTOR和AKT總量不變，其活化蛋白水平在黃芩素作用下顯著降低，而加入EGF后又再次增加。結論: 黃芩素可通過抑制AKT-mTOR通路誘導乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞自噬。

黃芩素； 乳腺癌細胞； 自噬； AKT-mTOR信號通路

乳腺癌是一種在女性中發病率較高的癌癥，2015年公布的中國腫瘤臨床數據顯示，其發生率占了所有女性腫瘤的15%，居于首位，且呈現逐年上升和年輕化的趨勢[1]。因此，針對乳腺癌的研究一直是抗腫瘤研究的重點。

黃芩素(baicalein)是從唇形科植物黃芩根部提取的一種黃酮類單體，其具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物學活性。研究表明，黃芩素在包括乳腺癌、胃癌、肝癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤中均具有抗腫瘤活性[2-5]。其抗腫瘤作用主要包括抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、抑制其侵襲轉移等[2-6]。自噬是近年來開始被廣泛關注和研究的一種不同于凋亡的新的細胞降解途徑。目前已經有不少黃酮類化合物誘導自噬抗腫瘤的作用機制被揭示[7-8]，然而黃芩素是否誘導乳腺癌自噬，目前少有報道。因此，本研究采用乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞作為工具，研究黃芩素與乳腺癌細胞自噬的關系。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞株 人乳腺癌MCF-7細胞株和小鼠乳腺癌4T1細胞株均購自中科院上海生物所細胞庫。

1.2 主要試劑和藥物 黃芩素(含量98%)購自于上海中藥標準化研究中心，臨用前DMSO溶解配制0.1 mol/L母液待用。細胞培養基RPMI-1640為Gibco產品；新生牛血清購自于杭州四季青生物工程公司；Annexin V/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；MTT粉末和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Sigma；抗LC3抗體購自Cell Signaling，其它 I 抗均購自Santa Cruz；II 抗為LI-COR產品。表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)購買自PeproTech。

2 方法

2.1 細胞培養 將貼壁的MCF-7細胞和4T1細胞培養于含10%新生牛血清和1×105U/L青、鏈霉素的RPMI-1640培養基的培養瓶中，并置于37 ℃培養箱中培養(5% CO2，相對濕度飽和)，每2～3 d傳代1次。

2.2 MTT檢測乳腺癌細胞活力 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，將MCF-7細胞和4T1細胞以1×108/L密度接種于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培養箱孵育24 h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)。吸去培養基，分別加入6.25、12.5、25、50、100、200和400 μmol/L的黃芩素，每個濃度設置6～8個復孔，5% CO2、37 ℃培養箱中分別孵育24 h，48 h和72 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。每孔加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h。4 h后，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度。

2.3 流式細胞術檢測凋亡 將MCF-7細胞和4T1細胞分別以2×108/L密度接種于6孔板中，每孔1 mL。5% CO2、37 ℃培養箱中繼續孵育24 h至細胞密度約70%～80%。去除培養基，加入含25、50和100 μmol/L的黃芩素的培養基繼續培養48 h后，抑制劑組加入10 mmol/L 的3-MA繼續作用2 h，消化收集細胞，PBS清洗1次，加入0.5 mL的buffer重懸細胞，分別加入5 μL的Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)兩種熒光染料避光孵育15 min，上機檢測。

2.4 Western blot檢測細胞自噬相關蛋白LC3的表達 將2×108/L的MCF-7細胞和4T1細胞接種于6孔板中(每孔1 mL)，待細胞生長至60%～70%，去除培養基，正常組給予正常培養基，給藥組分別給予黃芩素25、50和100 μmol/L，黃芩素加3-MA(10 mmol/L)以及黃芩素加EGF(1 μg/L)48 h，其中3-MA在收細胞前2 h加入，EGF在黃芩素作用48 h后給予，并繼續孵育6 h，消化收集細胞，800×g離心，5 min。去上清后加入事先配好的細胞裂解液，4 ℃裂解30 min后，12 000 r/min離心15 min。將上清轉移到新管中加入loading buffer，混勻后沸水浴變性，-20 ℃保存。

將蛋白樣品加入配制好的SDS聚丙烯凝膠泳道中，電泳2～3 h后，取凝膠并將其切成固定大小，通過蛋白轉印系統將凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上后，將膜置于5%脫脂牛奶封閉2 h。PBS洗去封閉液，加入含一定濃度 I 抗的PBST緩沖液中4 ℃孵育過夜。第2天將膜用PBST洗 10 min×3次，避光室溫用含 II 抗的PBST緩沖液繼續孵育2 h，避光洗去 II 抗，采用Odyssey近紅外掃描儀，Odyssey軟件分析其表達。

2.5 Western blot檢測相關信號通路蛋白的表達 將2×108/L的MCF-7細胞和4T1細胞接種于6孔板中，待細胞生長至60%～70%，去除培養基，正常組給予正常培養基，給藥組分別給予黃芩素50和100 μmol/L，黃芩素加EGF (1 μg/L)，共同孵育48 h。其中EGF在黃芩素作用48 h后給予，并繼續孵育6 h，收集細胞。蛋白提取及檢測步驟同2.4。

3 統計學處理

數據使用SPSS 19.0軟件統計分析。計量資料均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 黃芩素對乳腺癌細胞活力的抑制作用

濃度為6.25、12.5、25、50、100、200和400 μmol/L的黃芩素對乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞分別作用24 h、48 h和72 h，從圖1A中可知，隨著黃芩素濃度的提高和作用時間的延長，其對MCF-7細胞和4T1細胞的活力抑制逐漸增強，表現為劑量和時間的依賴性。同時，圖1B鏡下細胞觀察表明，50和100 μmol/L黃芩素作用48 h后壞死細胞增多，貼壁細胞內空泡顯著增加。根據該結果，我們選擇25、50和100 μmol/L作為后續實驗的研究濃度。

Figure 1.Inhibitory effect of baicalein on breast cancer cells. A： inhibition rates of both MCF-7 and 4T1 cells treated with 6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 and 400 μmol/L baicalein for 24， 48 and 72 h detected by MTT assay. Mean±SD.n=6. B： morphological changes of both MCF-7 and 4T1 cells treated with 25, 50 and 100 μmol/L baicalein for 48 h (×200).

圖1 黃芩素對乳腺癌細胞的抑制作用。

2 黃芩素誘導乳腺癌細胞自噬和凋亡的關系

基于黃芩素可誘導細胞凋亡的作用，我們考察了黃芩素誘導2種乳腺癌細胞自噬和凋亡的關系。圖2是黃芩素作用下，MCF-7細胞和4T1細胞流式細胞術雙染的實驗結果。50和100 μmol/L黃芩素可顯著誘導2種細胞凋亡，但總體程度不高(10%～20%)。當給予自噬抑制劑3-MA后，MCF-7細胞和4T1細胞的凋亡和壞死程度均顯著提高，提示部分原本誘導自噬的細胞可能通過凋亡和壞死的方式發生自我降解。

Figure 2.Effects of baicalein on apoptosis and necrosis of breast cancer cells. Mean±SD.n= 3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△P<0.05vs100 μmol/L baicalein group.

圖2 黃芩素對乳腺癌細胞凋亡和壞死的影響

3 黃芩素對乳腺癌細胞中LC3表達的影響

為了進一步確認黃芩素對乳腺癌細胞自噬的影響，我們通過Western blot檢測LC3的表達發現，50和100 μmol/L黃芩素作用下，LC3-II的蛋白水平顯著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明顯增大(P<0.01)。而加入抑制劑3-MA后，與黃芩素單用組相比，聯合自噬抑制劑組的自噬程度顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.Effects of baicalein on the expression of LC3 protein in breast cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△△P<0.01vs100 μmol/L baicalein group.

圖3 黃芩素對乳腺癌細胞LC3蛋白表達的影響

4 黃芩素誘導乳腺癌細胞自噬的相關通路蛋白的表達

從圖4可見，MCF-7細胞和4T1細胞在50和100 μmol/L黃芩素作用下，p-mTOR和p-AKT的蛋白水平顯著降低(P<0.01)。為了進一步確認黃芩素誘導乳腺癌自噬與AKT-mTOR信號通路的關系，我們采用AKT-mTOR信號通路激活劑EGF[9]，結果表明，50 μmol/L黃芩素組中，EGF加入后細胞內p-mTOR和p-AKT再次被活化(P<0.01)，同時LC3-II/LC3-I比值相比50 μmol/L黃芩素組有明顯降低(P<0.01)。而黃芩素對mTOR和AKT的總蛋白水平無明顯影響。

討 論

自噬是一種保守的細胞自我降解方式，是通過溶酶體吞噬自身胞質或細胞器達到細胞內營養和能量再利用的過程。基礎水平的自噬是維持細胞穩態所必需的，參與發育、免疫和抗衰老等多種生理過程。當外界因素，如缺氧、饑餓、藥物作用等條件下，細胞內自噬調控基因會啟動，將待降解胞質或受損的細胞器包裝形成自噬體，并且通過與溶酶體融合，將其降解利用，客觀上保護細胞的存活。然而，當外界環境進一步惡化，細胞將啟動程序性死亡過程。因此，自噬對細胞的調控具有雙重性，是不同于凋亡的一種新的調控機制[10]。

微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是在哺乳動物中發現的酵母自噬相關基因atg8的同源體，在正常細胞中低表達。LC3有2種活化的亞型： LC3-I和LC3-II。當發生自噬時，細胞內LC3前體(pro-LC3)通過轉化為LC3-I并進一步水解為LC3-II被招募至自噬體膜上，因此檢測LC3-II的含量可反映細胞內自噬的水平，LC3-II/LC3-I比值升高被認為是自噬體形成的標志[11]。我們發現，在黃芩素作用下乳腺癌MCF-7和4T1細胞內LC3-II/LC3-I比值均顯著增加，表明黃芩素作用后MCF-7細胞和4T1細胞內自噬體顯著增加。3-MA是一種常用的自噬抑制劑，可選擇性抑制自噬相關蛋白Vps34和PI3Kγ[12]，阻斷PI3Kγ參與介導的自噬途徑。我們發現3-MA作用下，3-MA聯合黃芩素組較單用黃芩素組，其細胞內蛋白表達水平的LC3-II/LC3-I比值顯著降低，而流式凋亡和壞死增加，表明黃芩素可誘導MCF-7細胞和4T1細胞自噬，同時提示，其作用途徑有PI3Kγ參與。

目前在中藥中，許多黃酮類提取物和單體均已被證明能夠誘導腫瘤細胞自噬進而死亡，從而發揮抗腫瘤作用[7-8]，黃芩素作為一種黃酮類中藥單體，其誘導自噬作用近年來已經得到體內外實驗證實。有研究發現，在大鼠體內，黃芩素通過血紅素加氧酶1誘導正常肝細胞自噬，降低肝臟缺血和再灌注損傷[13]。在肝癌細胞中，分別有研究表明，黃芩素可通過內質網應激和AKT/mTOR通路，誘導細胞自噬[14-15]。Aryal等[16]發現，黃芩素可通過 AMPK/ULK1/mTOR通路誘導前列腺癌自噬。此外，在卵巢癌中，黃芩素可通過抑制ERK和AKT誘導腫瘤細胞自噬[17]。因此，黃芩素在多種細胞，尤其是腫瘤細胞中誘導自噬作用是較為明確的，并且可能與AKT和mTOR相關。

Figure 4.Effects of baicalein on the protein levels of p-mTOR, mTOR, p-AKT and AKT in breast cancer cells. A: MCF-7 cells； B: 4T1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs50 μmol/L baicalein group；△△P<0.01vs100 μmol/L baicalein group.

圖4 黃芩素對乳腺癌細胞中p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT蛋白水平的影響

目前已經發現的調控自噬的上游相關信號通路有多條，包括mTOR、PI3K/AKT、ROS和NF-κB信號通路等。其中被廣泛認可的最主要的一條是mTOR信號通路，其作用核心蛋白mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關鍵蛋白[18]。mTOR是目前自噬調控最主要的信號通路蛋白之一，而AKT是其上游重要的調控分子，因此，我們考察了這2個蛋白及其活化形式的變化，發現黃芩素可顯著抑制MCF-7和4T1細胞內mTOR的活化。PI3K/AKT信號通路是mTOR上游與細胞增殖，存活和凋亡相關的信號通路，是調控自噬相關mTOR的主要上游信號通路之一[19-20]。我們發現黃芩素能夠抑制AKT的活化而對總的AKT影響不大。因此，我們推測PI3K/AKT信號通路可能介導了黃芩素對mTOR表達的抑制。進一步的，我們通過生長因子EGF重新激活AKT/mTOR通路，LC3-II/LC3-I比值顯著降低。

綜上所述，本實驗通過自噬標志物和自噬抑制劑，研究黃芩素對乳腺癌MCF-7細胞和4T1細胞自噬的影響，發現一定劑量的黃芩素可誘導乳腺癌細胞自噬，并且該作用可能通過抑制細胞存活的PI3K/AKT通路，進而影響mTOR通路的活化發揮作用。該實驗結果為黃芩素在乳腺癌方面的臨床應用提供了一定的實驗基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Baicalein induces autophagy in breast cancer cells

LING Yun1, 2, TU Jue1, 2, CAI Zhao-wei1, 2, CAI Yue-qin1, 2, CHU Yan-qing1, CHEN Min-li1, 2

(1AnimalExperimentalResearchCenter,2InstituteofComparativeMedicine，ZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China.E-mail: 18465129@qq.com)

AIM: To investigate the autophagy of breast cancer cells induced by baicalein and to explore its mechanism. METHODS: The effects of baicalein on the viability of MCF-7 cells and 4T1 cells were investigated by MTT assay, and the dosage of the drug was determined. The expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II) and LC3-I in the MCF-7 cells and 4T1 cells treated with baicalein at doses of 25, 50 and 100 μmol/L, or combined with autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) were determined by Western blot. In order to confirm the role of baicalein in autophagy, the effect of 3-MA on the apoptosis of both MCF-7 cells and 4T1 cells induced by baicalein was analyzed by flow cytometry. The protein levels of p-mTOR, mTOR, p-AKT and AKT were examined by Western blot and the role of AKT-mTOR pathway in the induction of autophagy in breast cancer induced by baicalein was determined by the combination of activators. RESULTS: Baicalein at 50 μmol/L and above doses significantly inhibited the viability of breast cancer cells in a dose- and time-dependent manner. The expression of LC3-II/LC3-I in both MCF-7 cells and 4T1 cells was significantly enhanced after the action of baicalein, and the ratio of LC3-II/LC3-I was significantly decreased after 3-MA addition. The results of flow cytometry showed that, compared with baicalein group, the combination of baicalein and 3-MA promoted the levels of necrosis and apoptosis. Moreover, the protein levels of p-mTOR and p-AKT were significantly decreased and were rescued by EGF， while their total protein levels were not changed.CONCLUSION: Baicalein induces autophagy through AKT-mTOR pathway both in MCF-7 cells and 4T1 cells.

Baicalein; Breast cancer; Autophagy; ATK-mTOR signal pathway

1000- 4718(2017)07- 1171- 06

2016- 10- 18

2017- 05- 09

浙江省自然科學基金(No. LQ13H280004)；浙江中醫藥大學校級科技創新團隊(No. XTD201301)

R979.19； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.003

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