EPO通過激活PI3K/Akt途徑上調HSP70的表達對低溫下心衰大鼠起保護作用*

鄧琴琴， 王夢洪， 裴兆輝

(1南昌市第三醫院心內二科， 江西 南昌 330009； 2南昌大學第一附屬醫院心內科， 江西 南昌 330006)

EPO通過激活PI3K/Akt途徑上調HSP70的表達對低溫下心衰大鼠起保護作用*

鄧琴琴1， 王夢洪2 △， 裴兆輝1

(1南昌市第三醫院心內二科， 江西 南昌 330009；2南昌大學第一附屬醫院心內科， 江西 南昌 330006)

目的： 評價紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)對低溫環境下心衰大鼠的影響，探討其可能的作用機制。方法: 80只SD大鼠隨機分5組，分別為對照組(CON組)、心衰低溫組(HFLT組)、心衰常溫組(HFNT組)、心衰低溫EPO組(HFLT+EPO組)和心衰低溫LY294002組(HFLT+EPO+LY組)。然后將所有大鼠放置于氣候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組為低溫環境；HFNT組為常溫)。超聲心動圖檢測各組大鼠心功能，然后處死大鼠并留取心臟標本，TUNEL法測心肌細胞凋亡，熒光定量PCR測心肌組織中Fas和PI3K mRNA的表達，Western blot測大鼠心肌組織中熱休克蛋白70(HSP70)、Akt和p-Akt的水平。結果: 低溫下心衰大鼠心功能明顯低于常溫下心衰大鼠，HFLT+EPO組大鼠心功能較HFLT組明顯改善，給予LY294002干預后HFLT+EPO+LY組大鼠心功能明顯低于HFLT+EPO組；HFLT組及HFNT組凋亡指數均高于CON組(P<0.01)，HFLT組凋亡指數又明顯高于HFNT組(P<0.05)，HFLT+EPO組凋亡指數明顯低于HFLT組(P<0.01)。Fas mRNA在HFLT組心肌組織中的表達明顯高于HFNT組，PI3K mRNA在HFLT組和HFNT組心肌組織中的表達差異無統計學顯著性，HFLT+EPO組心肌組織中Fas的mRNA表達明顯低于HFLT組(P<0.01)和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)，而PI3K的mRNA表達則明顯高于HFLT組和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)。HFLT+EPO組大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的水平明顯高于HFLT組和HFLT+EPO+LY組(P<0.05)，CON、HFLT和HFNT組大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的蛋白水平差異無統計學顯著性。所有大鼠心肌組織中Akt的水平差異無統計學顯著性。結論: EPO活化PI3K/Akt后，上調內源性保護途徑中HSP70的表達并抑制細胞凋亡，從而對低溫下的心衰大鼠心臟起保護作用。

紅細胞生成素； 低溫； 心力衰竭； PI3K/Akt信號通路

大量研究表明低溫會加重心力衰竭(heart fai-lure，HF)患者的臨床癥狀，增加住院率和死亡率[1-2]。研究表明加重的原因可能與低溫引起的感冒有關[3]。為進一步增加心衰患者對低溫的抵抗力，需要尋找新的藥物進一步改善患者的心功能。紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)具有促進造血、抗凋亡、抗炎、促干細胞遷移等多種功能，最近發現其對心肌細胞尚有保護作用，但EPO在低溫環境下對心肌細胞是否具有保護作用研究甚少，本實驗使用心衰大鼠模型研究EPO對低溫環境下心衰大鼠是否起保護作用，并通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt途徑探討EPO對低溫環境下心衰大鼠的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 健康雄性純種SD大鼠80只，體重250～270 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.2 試劑及儀器 TRIzol RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒及Real Master Mix均購自天根公司；TUNEL試劑盒、LY294002及二甲基亞砜均購自Promega；阿霉素及EPO均購自Sigma；兔抗熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)單克隆抗體及羊抗Akt、p-Akt單克隆抗體均購自Abcam；小鼠抗β-actin單克隆抗體及HRP標記的 II 抗均購自北京中杉金橋公司；ECL超敏發光劑為Thermo產品；蛋白抽提試劑盒購自北京普利來公司。751-GM紫外分光光度計(上海惠普分析儀器有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾集團公司)；水平電泳槽、垂直板蛋白電泳裝置(Bio-Rad)；熒光定量PCR儀(Beckman)；顯微鏡(Olympus)；臺式低溫高速離心機(Heraeus)；蛋白轉移裝置(北京六一儀器廠)；氣候箱(南京艾賽特科技發展有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型的建立及分組 雄性SD大鼠80只，體重250～270 g，隨機分5組：對照(control，CON)組8只；心衰低溫(heart failure in low temperature，HFLT)組20只；心衰常溫(heart failure in low temperature，HFNT)組20只；心衰低溫EPO組(HFLT+EPO組)14只；心衰低溫LY294002(LY)組(HFLT+EPO+LY組)18只。(1) HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組均予腹腔注射阿霉素制作大鼠心衰模型(每周2次，每次2.5 mg/kg，共5周)，CON組予同體積的生理鹽水5周； (2) 造模后，HFLT+EPO+LY組尾靜脈注射LY294002(0.3 mg·kg-1·d-1)，CON、HFLT、HFNT和HFLT+EPO組均予尾靜脈注射同體積的生理鹽水；30 min后，HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組腹腔注射EPO(4 000 U·kg-1·d-1)，CON、HFLT和HFNT組均予同體積的生理鹽水；然后將所有大鼠放置于氣候箱中(CON、HFLT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組為4 ℃，3 h；HFNT組溫度與外界溫度相同，3 h)，整個過程重復4 d。

2.2 超聲心動圖檢查 選用GE Vivid 7彩色多譜勒超聲診斷儀，高頻探頭(12 MHz)，寬頻線陣，Gain 50 dB，深度2.5 cm。置于氣候箱后2 h進行，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于木板上，胸部脫毛，接心電圖，取大鼠胸骨旁左室長軸切面測量左室舒張末期內徑(left ventricular internal dimension at end-diastole ，LVIDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular internal dimension at end-systole，LVIDs)、射血分數(ejection fraction，EF)和縮短分數(fractional shortening，FS)。

2.3 Western blot實驗檢測心肌組織中HSP70、p-Akt和Akt的水平 稱取100 mg大鼠心肌組織剪碎，加入1 mL的裂解液勻漿(所有步驟均在冰上操作)。10 000×g離心10 min 后加入蛋白抽提試劑2 mL。10 000×g離心10 min后。溶液分為2層，中間為一層白色的蛋白膜。去除蛋白膜上下兩層液體，室溫干燥5 min，加入300 μL 4% SDS及300 μL 2×上樣緩沖液充分混勻，95 ℃加熱變性10 min。取制備的蛋白樣品12 μL進行10% SDS-PAGE,蛋白分離后電轉移至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h ；分別加入抗HSP70、p-Akt、Akt、α-actin 等 I 抗(除HSP70為1∶10 000外，其余均為1∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標記的 II 抗孵育4 h。用ECL發光劑，暗室曝光后凝膠成像系統進行圖像分析處理。

2.4 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 實驗步驟嚴格按照細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書進行。左心室組織固定、包埋、切片；脫蠟；體積分數0.3%的H2O2封閉30 min；20 mg/L蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白；加TUNEL反應液，37 ℃孵育70 min；加入抗熒光素抗體；DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，封片。以不加TdT酶者為陰性對照，分別以用Dnase1(10 mg/L)消化的左心室心肌切片為陽性對照。正常心肌細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞核呈棕黃色。每只大鼠觀察4張切片，每張切片在40倍視野下，隨機計數5個不同視野的凋亡細胞及細胞總數，計算凋亡細胞數占總細胞的百分率即凋亡指數(apoptotic index，AI)。

2.5 熒光定量PCR測定心肌Fas和PI3K的mRNA表達 取100 mg左右的心肌組織加入約1 mL TRIzol，用RNA 提取試劑盒提取心肌總RNA，隨后按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA。引物序列由上海捷瑞生物技術有限公司合成。Fas 的上游引物為5’-CGCCTATGGTTGTTGACC-3’，下游引物為5’-CTCCAGACATTGTCTCC-3’，擴增片段為477 bp；PI3K的上游引物為5’-AGATGCTTTCAAACGCTAT-3’；下游引物為5’-GCTGTCGCTCACTCCA-3’，擴增片段為359 bp；GAPDH的上游引物為5’-AGGCCGGCTTCGCGGGCG-3’，下游引物為5’-CTCGGGAGCCACACGCAG-3’，產物為450 bp。在ABI 7500型全自動實時熒光定量PCR儀上擴增并檢測熒光。擴增參數： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s， 53 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 35個循環； 72 ℃ 7 min。反應結束后，進行熔解曲線的測定，反應條件： 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。

3 統計學處理

用SPSS 14.0 統計軟件對所得結果進行處理，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 實驗動物存活評價

實驗末存活大鼠50只，其中CON組8只，HFLT組和HFLT+EPO組剩9只，HFLT+EPO+LY組余10只，HFNT組剩14只。11只大鼠在造模期間死于心力衰竭，其中CON組無死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組分別死亡3、4、2和2只，另有19只死于氣候箱中，CON組無死亡，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組各分別死亡8、2、3和6只。

2 心臟超聲測定結果

與CON組相比，HFLT組經阿霉素處理后，LVIDd和LVIDs明顯增加(P<0.01)，EF和FS明顯降低(P<0.01)；與HFNT組相比，HFLT組LVIDd、LVIDs增加(P<0.05)，EF和FS降低(P<0.05)，顯示低溫能進一步使心功能惡化；與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理能降低LVIDd和LVIDs(P<0.01)，增加EF和FS(P<0.01)；與HFLT+EPO組相比，HFLT+EPO+LY組LVIDd和LVIDs減低(P<0.05)，EF和FS增加(P<0.05)，見圖1、表1。

3 TUNEL法測定結果

光鏡下CON組偶見凋亡細胞，凋亡指數為4.21±0.88，HFLT、HFNT、HFLT+EPO和HFLT+EPO+LY組均可見明顯凋亡細胞(其細胞核為棕褐色)，凋亡指數分別為28.79±3.10、23.56±2.20、11.45±1.50和24.63±2.33。CON組無明顯心肌細胞凋亡，HFLT組及HFNT組均有明顯的細胞凋亡，且凋亡指數均高于CON組(P<0.01)，HFLT組凋亡指數又明顯高于HFNT組(P<0.05)，HFLT+EPO組凋亡指數明顯低于HFLT組(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.Ultrasonic cardiogram of the rats in each group.

圖1 超聲心動圖檢測5組SD大鼠心臟功能的超聲心動圖

表1 各組SD大鼠心功能指標情況

LVIDd: left ventricular internal dimension at end-diastole; LVIDs: left ventricular internal dimension at end-systole; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.**P< 0. 01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

Figure 2.Apoptosis of left ventricular myocardial tissues from the rats in each group (TNUEL, the scale bar=20 μm). Mean±SD.n=4.*P<0.01vsCON;#P<0.05，##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

圖2 TUNEL法檢測5組SD大鼠左室心肌細胞凋亡情況

4 qPCR檢測結果

與CON組相比，HFLT組Fas的mRNA表達明顯增加(P<0.01)，PI3K的mRNA表達下降(P<0.01)；與HFNT組相比，HFLT組的低溫處理能提高Fas的mRNA表達(P<0.05)，但對PI3K的mRNA表達無影響；與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理能降低Fas的mRNA表達(P<0.01)，增加PI3K的mRNA表達(P<0.01)；與HFLT+EPO組相比，HFLT+EPO+LY組Fas的mRNA表達增加(P<0.05)，PI3K的mRNA表達下降(P<0.05)，見表2。

表2 5組SD大鼠左室心肌組織PI3K和Fas的mRNA表達水平

Table 2.The mRNA expression of PI3K and Fas in left ventri-cular myocardial tissues from the rats in each group (Mean±SD)

GroupnFasmRNAPI3KmRNACON80.32±0.111.07±0.15HFLT90.87±0.13**0.95±0.37HENT140.68±0.25#1.01±0.22HFLT+EPO90.55±0.12##2.92±0.34##HFLT+EPO+LY100.69±0.16△1.59±0.13△

**P<0. 01vsCON;#P<0.05,##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

5 Western blot檢測結果

與HFLT組相比，HFLT+EPO組的EPO處理明顯增加大鼠心肌組織中p-Akt和HSP70的水平(P<0.01)，而HFLT+EPO+LY組的LY294002處理則能削弱EPO的上述作用(P<0.05)；CON、HFLT和HFNT組p-Akt和HSP70的表達幾乎一樣，顯示低溫和阿霉素處理對p-Akt和HSP70的水平無影響；所有大鼠心肌組織中Akt的水平無顯著差異，見圖3。

討 論

最近人們發現氣候，尤其是溫度能夠對心衰患者產生影響，大量研究表明低溫能夠使心衰患者的住院率及死亡率明顯增加，且原因可能是因為低溫使心衰患者的心功能惡化， Chang等[4]的研究證實了這一點，以低溫刺激心衰大鼠，大鼠的心功能出現進一步下降，而且心力衰竭的過程中常伴隨著心肌細胞的凋亡[5]。本研究通過利用阿霉素及氣候箱模擬構建低溫條件下大鼠心力衰竭模型，證實了低溫能夠使心衰大鼠心功能明顯下降并導致死亡，但對正常大鼠無明顯影響。故本研究以低溫環境下心衰大鼠作為實驗動物模型，尋找低溫環境下除傳統治療心衰藥物外的新型藥物。

Figure 3.The protein levels of HSP70, p-Akt and Akt in left ventricular myocardial tissues from the rats with different treatments. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsHFLT;△P<0.05vsHFLT+EPO.

圖3 5組SD大鼠左室心肌組織HSP70、p-Akt及Akt蛋白的表達

EPO是一種由腎臟分泌的糖蛋白，能與特異性的促紅細胞生成受體結合，刺激紅細胞的增殖與分化[6]，早期主要用于治療慢性貧血，然而近年來研究發現促紅細胞生成素不僅能夠促進紅細胞生成且能夠對心肌細胞及心臟功能起保護作用[7]。而van der Meer等[8]進一步證實在大鼠的心臟內存在功能性促紅細胞生成素受體，且在大鼠心臟的缺血再灌注期，給予EPO能夠顯著改善左室功能，減輕心肌組織的損傷。

PI3K/Akt信號通路是近年來發現的體內重要的信號轉導通路之一，已經證實它可以介導多種細胞的保護作用，包括心肌細胞。有文獻表明Akt活化后可上調HSP70的表達，而熱休克蛋白是公認的保護性蛋白，HSP70是其重要成員之一，低溫、缺氧等均可誘導其產生并對大鼠心肌細胞起保護作用[9-10]。此外另有研究表明PI3K/Akt在抵抗Fas調節的細胞凋亡中起著主要作用[11]，即PI3K/Akt對心肌細胞起保護作用的機制還可能與其抗心肌細胞凋亡有關，本研究結果提示低溫環境下心衰大鼠心肌細胞凋亡數明顯增加，射血分數明顯降低，說明心衰大鼠的心功能在低溫的刺激下進一步下降，進一步的研究表明低溫下心衰大鼠心肌細胞中Fas的 mRNA表達明顯升高，HSP70及PI3K的mRNA表達則未見明顯升高，與Tanonaka等[9]的研究不符，這可能是因為心衰大鼠較正常大鼠對低溫刺激的反應性降低所致，由此可見低溫不能誘導心衰大鼠心肌細胞中HSP70的升高并對大鼠心肌細胞起保護作用。而經EPO處理后心衰大鼠心肌細胞中HSP70和PI3K的mRNA表達明顯升高，Fas的mRNA表達則明顯降低，同時心肌細胞凋亡數明顯減少，射血分數明顯升高，說明心功能得到明顯改善，而LY294002則可阻斷這一作用。由此可見EPO的心肌細胞保護機制是由PI3K/Akt途徑介導的。

綜上所述，EPO能改善心衰大鼠的心功能，進一步增強其對低溫的耐受力，除治療貧血外也是一種高效的心臟保護劑。其作用基礎可能是通過激活PI3K/Akt途徑，增加HSP70的表達、抗心肌凋亡等保護受損的心肌，這其中是否還有其它信號通路的參與，尚需進一步的考證。相信隨著對EPO作用及其機制的深入研究，EPO及其衍生物必將成為心臟保護治療的一種新方法。

[1] Gotsman I, Zwas D, Admon D, et al. Seasonal variation in hospital admissi-on in patients with heart failure and its effect on prognosis [J]. Cardiology, 2010, 117(4):268-274.

[2] Warren-Gash C, Bhaskaran K, Hayward A, et al. Circulating influenza virus, climatic factors, and acute myocardial infarction: a time series study in England and Wales and Hong Kong[J]. J Infect Dis, 2011, 203(12):1710-1718.

[3] von Klot S, Zanobetti A, Schwartz J. Influenza epidemics, seasonality, and the effects of cold weather on cardiac mortality. Influenza epidemics, seasonality, and the effects of cold weather on cardiac mortality[J]. Environ Health, 2012, 11:74.

[4] Chang Q, Natelson BH, Ottenweller JE, et al. The role of stressor intensity in influencing the course of heart disease in cardiomyopathic hamsters[J]. Pros Soc Exp Biol Med, 1996, 212(3):248-255.

[5] 米亞非， 李小鷹， 江 建， 等. rAAV-1SERCA2a 轉染改善心力衰竭犬心功能及其機制探討[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):208-213.

[6] Silva M, Benito A, Sanz C, et al. Erythropoietin can induce the expression of Bcl-xLthrough Stat5 in erythropoietin-dependent progenitor cell lines[J]. J Biol Chem, 1999, 274(32):22165-22169.

[7] 張新金， 馬業新， 文 淵， 等. 促紅細胞生成素通過PI3K/Akt信號通路抑制血管緊張素II誘導的新生大鼠心臟成纖維細胞增殖[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(2):293-298.

[8] van der Meer P, Lipsic E, Henning RH, et al. Erythropoietin improves left ventricular function and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusion injury[J]. Eur J Heart Fail, 2004, 6(7):853-859.

[9] Tanonaka K, Yoshida H, Toga W, et al. Myocardial heat shock proteins during the development of heart failure[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 283(2):520-525.

[10]張偉華， 王麗娜， 李全鳳， 等. 熱休克蛋白70對H2O2誘發大鼠心肌細胞凋亡的保護作用[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(3):402-406.

[11]Oaaki M, Kase S, Adachi K, et al. Inhibition of the PI3K-Akt signaling path-way enhances the sensitivity of Fas-mediated apoptosis in human gastric carcinoma cell line, MKN-45[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130(1):8-14.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Erythropoietin protects rats with heart failure in hypothermia by activating PI3K/Akt pathway and upregulating the expression of HSP70

DENG Qin-qin1, WANG Meng-hong2， PEI Zhao-hui1

(1TheSecondDepartmentofCardiology,NanchangThirdMunicipalHospital,Nanchang330009,China2DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wmh666888@sina.com)

AIM: To investigate the effect oferythropoietin (EPO) on the rats with heart failure (HF) in hypothermia and to explore its underlying mechanism. METHODS: The Sprague-Dawley rats (n=80) were randomly divided into five groups: control group (CON group), HF in low-temperature group (HFLT group), HF in normal temperature group (HFNT group), HF with EPO in low temperature group (HFLT+EPO group), and HF with EPO and LY2940002 in low temperature group (HFLT+EPO+LY group). All rats were housed in artifitial climate chamber. The animals in CON, HFLT, HFLT+EPO and HFLT+EPO+LY groups were under the low-temperature environment， while those in HFNT group were under normal temperature. The heart function was evaluated by echocardiography. The rats were then executed and the hearts were harvested. The apoptosis of myocytes was assessed by TUNEL method. The mRNA expression of Fas and PI3K was detected by fluorescence quantitative PCR (qPCR) and the protein levels of HSP70, Akt and p-Akt in the myocardial tissues were determined by Western blot. RESULTS: The rat cardiac functions in HFLT group were significantly deteriorated compared with HFNT group. The cardiac functions in HFLT+EPO group were improved compared with HFLT group. The cardiac functions in HFLT+EPO+LY group were significantly pejorated compared with HFLT+EPO group. The apoptotic index of the myocardium in HFLT group and HFNT group was significantly higher than that in CON group (P<0.01). The apoptotic index of the myocardium in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group (P<0.05).The apoptotic index of the myocardium in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group (P<0.01).The mRNA expression of Fas in HFLT group was significantly higher than that in HFNT group, and no obvious difference of the mRNA expression level of PI3K between HFLT group and HFNT group was observed. The mRNA expression of PI3K in HFLT+EPO group was significantly lower than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and that in HFLT+EPO group was significantly higher than that in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05). The protein levels of p-Akt and HSP70 in HFLT+EPO group was also higher than those in HFLT group and HFLT+EPO+LY group (P<0.05), and no obvious difference of the protein levels of p-Akt and HSP70 in CON, HFLT and HFNT groups was found. The protein level of Akt had no significant difference in each group. CONCLUSION: The pathway of PI3K/Akt may be one of the cardioprotective ways of EPO. EPO activates the PI3K/Akt pathway， upregulates the experssion of HSP70 (an endogenous protective factor) and inhibits the apoptosis, thus protecting the cardiac functions in the rats with HF in hypothermia.

Erythropoietin; Hypothermia; Heart failure; PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2017)07- 1203- 06

2016- 09- 20

2017- 05- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 81260293)

R363.1+23； R541.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.008

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0791-88692501； E-mail： wmh666888@sina.com