PI3K/Akt/eNOS信號通路在葛根素抑制ox-LDL誘導的血管內皮細胞組織因子表達中的作用*

鄧華菲， 李 堅， 周 琴， 譚玉林， 謝 明， 張天杰， 韓 瑛， 張文龍

(1湘南學院基礎醫學院， 2郴州市第一人民醫院神經內科， 湖南 郴州 423000)

PI3K/Akt/eNOS信號通路在葛根素抑制ox-LDL誘導的血管內皮細胞組織因子表達中的作用*

鄧華菲1， 李 堅1， 周 琴1， 譚玉林1， 謝 明1， 張天杰1， 韓 瑛1， 張文龍2△

(1湘南學院基礎醫學院，2郴州市第一人民醫院神經內科， 湖南 郴州 423000)

目的： 探討磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B/內皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信號通路在葛根素(puerarin)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)誘導的血管內皮細胞組織因子(tissue factor，TF)表達中的作用。方法: 實時熒光定量PCR檢測TF的mRNA表達，Western blot檢測TF和Akt的蛋白表達，硝酸鹽還原酶法檢測一氧化氮(nitric oxide， NO)含量。結果: 與對照組相比，ox-LDL孵育內皮細胞后，內皮細胞TF的mRNA和蛋白表達升高，Akt蛋白磷酸化水平降低，細胞內NO產生減少；而葛根素預孵育內皮細胞1 h后，再用ox-LDL孵育，內皮細胞TF mRNA和蛋白表達下降，Akt蛋白磷酸化升高，細胞內NO產生增多；PI3K抑制劑LY294002和葛根素共同預孵育內皮細胞1 h后，再用ox-LDL孵育，內皮細胞TF的mRNA和蛋白表達升高，Akt蛋白磷酸化降低，細胞內NO產生減少；eNOS抑制劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和葛根素共同預孵育內皮細胞，也明顯阻斷葛根素對ox-LDL誘導的內皮細胞TF mRNA和蛋白表達、細胞Akt蛋白磷酸化和細胞內NO產生的作用。結論: 葛根素可通過上調PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞TF mRNA和蛋白表達。

葛根素； 氧化型低密度脂蛋白； 組織因子； PI3K/Akt/eNOS信號通路； 血管內皮細胞

冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂導致血栓形成是急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)最主要的發病機制。組織因子(tissue factor，TF)即凝血因子Ⅲ，是啟動體內凝血過程的重要因子。Emekli-Alturfan等[1]研究發現，與穩定性心絞痛患者和正常人相比，ACS患者血漿中TF抗原水平及其活性明顯升高(血漿TF水平常常作為ACS患者預后的重要指標[2])。正常情況下，血管內皮細胞和外周血細胞中測不到TF，故正常血液循環中不存在凝血的啟動，但在病理條件下血管內皮細胞可誘發性表達TF，特別是血管內皮細胞受到損傷或炎性因子刺激時TF表達顯著增多[3-4]，增加動脈血栓及粥樣硬化危險。

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作為獨立的危險因素在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)的發生發展過程及ACS的形成中占有重要地位, ox-LDL不僅可以損傷血管內皮細胞，使其由抗凝血向促凝血方向轉化，還能誘導血管內皮細胞表達TF[4]。ox-LDL誘導內皮細胞TF表達的信號轉導機制尚不完全清楚。實驗研究表明磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB/Akt)負調控內皮細胞TF表達[5]。Akt磷酸化內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)中第 1 177 位絲氨酸可使該酶活化，促進一氧化氮(nitric oxide，NO)產生。NO是強有力的血管舒張劑，能夠抑制平滑肌細胞增殖和血小板聚集，也能抑制TF在內皮細胞中的表達[6]。

葛根素(puerarin，Pue)是從干燥葛根中提取的一種異黃酮類化合物，具有明顯的抗動脈粥樣硬化[7]、保護血管內皮細胞和心肌細胞[8-9]、對抗鉛對腎臟的損傷[10]、影響骨的增殖和分化[11]、促進胰腺β細胞生存[12]的作用，這些保護作用與PI3K/Akt/eNOS信號通路有關[7-12]。近年來有學者研究發現葛根素能降低ACS患者外周血TF的表達水平[13]；汪自龍等[14]進一步發現葛根素能降低ACS患者體外單核源巨噬細胞TF的表達，并降低其活性；冉文卓等[15]研究表明葛根素可呈劑量和時間依賴性地抑制血管緊張素Ⅱ誘導的TF表達。目前本實驗室已研究發現葛根素能抑制ox-LDL對TF的誘導作用(另文發表)，但是其機制尚不清楚，為此我們以人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為研究對象，觀察PI3K/Akt/eNOS信號途徑是否介導了葛根素抑制ox-LDL誘導的TF表達，進一步探索葛根素對凝血系統活性的調控機制，為干預As血栓形成提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和材料

葛根素購自Sigma； ox-LDL購自上海翊圣生物科技有限公司；PI3K抑制劑LY294002和eNOS抑制劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)購自Selleck；Trizol、cDNA合成試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒分別購自Invitrogen、Fermentas和ABI；TF抗體購自Abcam； β-actin抗體購自Santa；Akt和p-Akt(Thr308)抗體購自CST；細胞蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和增強化學發光(ECL)試劑盒購自Pierce；胰蛋白酶和胎牛血清購自杭州四季青公司；TF和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養和實驗分組 以含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基培養HUVECs(中南大學湘雅醫學院實驗中心提供，內皮細胞特異性標志CD31陽性率≥95%)，每2～3 d更換細胞培養液并傳代，取處于對數生長期的細胞用于實驗。

實驗分組：正常對照(control)組：用含10%胎牛血清的DMEM培養HUVECs 24 h；ox-LDL組：用含ox-LDL(終濃度為50 mg/L)的DMEM孵育HUVECs 24 h；ox-LDL+葛根素組(ox-LDL+Pue組)：100 μmol/L葛根素預處理HUVECs 1 h后，再用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h；PI3K抑制劑組(LY294002組)：用PI3K抑制劑LY294002(10 μmol/L)和葛根素預處理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h；eNOS抑制劑組(L-NAME組)：用eNOS抑制劑L-NAME(100 μmol/L)和葛根素處理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h。

2.2 實時熒光定量PCR檢測TF的mRNA表達 Trizol提取細胞總RNA后融于無RNase水中，用紫外分光光度計檢測RNAA260/A280的比值并計算其濃度。用M-MuLV反轉錄酶將RNA合成cDNA后進行擴增。人TF的上游引物序列為5’-GCCAAGATGTACCTGGGCTA-3’，下游引物序列為5’-CATTCATGATCTTGGCGATG-3’，產物長度為220 bp；內參照采用β-actin，上游引物序列為5’-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3’，下游引物序列為5’-GTTGAAGGTAG TTTCGTGGA-3’，產物長度為208 bp。SYBR Green法進行實時熒光定量PCR反應。反應條件為： 94 ℃ 20 s， 60 ℃ 20 s， 72 ℃ 20 s，共40個循環； 72 ℃ 5 min。用CFX Manager軟件分析得到Ct值，經β-actin校正，以校正值2-ΔΔCt進行統計分析。ΔCt = Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt =ΔCt刺激組-ΔCt對照組(相對定量以含量最低的樣本為標準，其余各樣本的含量均為相對該樣本的倍數)。

2.3 Western blot實驗 冰上提取細胞總蛋白后用BCA法定量各樣本蛋白濃度。蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液后煮沸變性，每孔加入20 μg蛋白，經10% SDS-PAGE后，蛋白被轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶的TBST封閉2 h，然后分別與抗TF抗體(1∶1 000)、p-Akt抗體(1∶1 000)、Akt抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶800)4 ℃ 孵育過夜；充分洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的 II 抗(1∶4 000) 繼續孵育；再次洗膜后化學發光法顯影，對各條帶的灰度值掃描，以β-actin作為內參照，計算各樣本蛋白含量。

2.4 硝酸鹽還原酶法檢測細胞內NO含量 收集培養的各組細胞，用細胞裂解液裂解細胞，硝酸鹽還原酶法檢測細胞內NO含量，按NO檢測試劑盒說明，分光光度計于540 nm波長處測定各樣本吸光度值，并用BCA蛋白定量試劑盒檢測細胞內蛋白含量，計算單位蛋白中所含NO。

3 統計學處理

所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，結果用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析和圖形繪制。多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間差異的兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 葛根素抑制ox-LDL誘導TF mRNA和蛋白的表達

如圖1所示，50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h后，TF的mRNA和蛋白的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)；而用100 μmol/L葛根素預處理HUVECs 1 h后，再用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h，明顯減弱了ox-LDL誘導TF mRNA和蛋白表達的作用(P<0.01)。這些結果表明，葛根素抑制了ox-LDL誘導的HUVECs TF表達。

2 PI3K抑制劑和eNOS抑制劑對葛根素降低ox-LDL誘導的TF mRNA和蛋白表達的影響

有研究表明，PI3K-Akt信號通路對TF表達起負調控作用[5]，因此我們探討了葛根素是否通過活化PI3K-Akt通路抑制ox-LDL誘導TF表達。結果發現，PI3K抑制劑LY294002(10 μmol/L)和葛根素處理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL處理內皮細胞24 h，葛根素對ox-LDL誘導的TF mRNA和蛋白表達的作用明顯被抑制。NO可以抑制微血管內皮細胞TF表達[6]，因此我們也探討了葛根素是否通過增加NO的產生抑制ox-LDL誘導的TF表達。eNOS抑制劑L-NAME和葛根素處理HUVECs 1 h后，再加入50 mg/L ox-LDL處理內皮細胞24 h，葛根素對ox-LDL誘導的TF mRNA和蛋白的作用被阻斷，見圖1。

Figure 1.The effects of various drugs on ox-LDL-induced TF mRNA (A) and protein (B) expression in HUVECs determined by real-time quantitative PCR and Western blot, respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsox-LDL group;#P<0.05,##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

圖1 不同藥物對ox-LDL誘導的HUVECs TF mRNA和蛋白水平表達的影響

3 葛根素和LY294002對ox-LDL抑制內皮細胞Akt蛋白磷酸化的影響

為了探討PI3K-Akt通路是否參與葛根素抑制ox-LDL誘導TF表達，本實驗進一步檢測了各組細胞Akt蛋白的磷酸化。結果發現，與正常對照組相比，50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h后，Akt蛋白磷酸化明顯下降(P<0.01)；而用100 μmol /L葛根素預處理HUVECs 1 h，再用50 mg/L ox-LDL處理24 h，明顯減弱了ox-LDL對Akt蛋白磷酸化的抑制作用(P<0.01)；PI3K抑制劑LY294002明顯逆轉了葛根素的上述作用，見圖2。這些結果表明，ox-LDL通過抑制PI3K-Akt通路誘導了TF的表達，而葛根素減弱了ox-LDL對PI3K-Akt通路的抑制作用，從而抑制了TF的表達。

Figure 2.The effect of puerarin and LY294002 on the inhibition of Akt phosphorylation induced by ox-LDL in the HUVECs. Akt protein was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsox-LDL group;##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

圖2 葛根素和LY294002對ox-LDL抑制HUVECs 的Akt蛋白磷酸化的影響

4 葛根素、LY294002和L-NAME對ox-LDL抑制內皮細胞NO生成的影響

為了探討葛根素是否通過增加NO的產生抑制ox-LDL誘導TF表達，本實驗檢測了各組細胞內NO的含量。與正常對照組相比，50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h后，細胞內NO的產生明顯減少(P<0.01)；用100 μmol /L葛根素預處理HUVECs 1 h，再用50 mg/L ox-LDL處理HUVECs 24 h，細胞內NO的含量明顯增加(P<0.01)。eNOS抑制劑L-NAME逆轉了葛根素的效應，可見，NO的產生參與了葛根素降低ox-LDL對TF表達的誘導作用。同時，PI3K抑制劑LY294002也逆轉了葛根素降低ox-LDL對NO的抑制作用，因此，PI3K/Akt/eNOS信號通路參與了葛根素對ox-LDL誘導HUVECs TF mRNA和蛋白表達的抑制作用，見圖3。

Figure 3.The effect of puerarin, LY294002 and L-NAME on the inhibition of NO production induced by ox-LDL in the HUVECs. Intracellular NO content was determined by nitrate reduction method. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsox-LDL group;##P<0.01vsPue+ox-LDL group.

圖3 葛根素、LY294002和L-NAME對ox-LDL抑制內皮細胞產生NO的影響

討 論

As是ACS的重要病理基礎，而血栓的形成在As的形成和發展過程中起著重要作用。TF是外源性凝血途徑的關鍵因子，影響急性心肌梗死的過程，由于絕大多數的心肌梗死是因不穩定斑塊的破裂，繼而引起出血和管腔內血栓形成，而導致管腔閉塞，引起相應動脈部位的病變。生理狀態下，血管內皮細胞并不表達TF，但是炎癥因子、ox-LDL等刺激可以誘導血管內皮細胞表達TF[3-4]。本實驗用50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h后，細胞TF的mRNA和蛋白表達明顯增加，與上述研究結果一致。

ox-LDL對血管內皮細胞TF表達的誘導機制尚不完全清楚。有研究報道，PI3K/Akt是血管內皮細胞TF的負調控信號通路[5]。研究發現，PI3K抑制物wortmannin和LY294002孵育HUVECs，加強了VEGF對TF的誘導作用[16]；Akt去磷酸化還能促進凝血酶誘導TF表達[17]。本實驗發現50 mg/L ox-LDL孵育HUVECs 24 h后，細胞內Akt蛋白磷酸化降低，TF的mRNA和蛋白表達明顯增加，進一步證實PI3K/Akt負調控TF的表達。Akt磷酸化后可以促進eNOS活化，使細胞產生NO增多，而NO具有抑制血小板聚集和TF產生的作用[6]。本實驗發現50 mg/L ox-LDL使HUVECs內NO產生減少而TF表達增加，由此可以得出抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路促進了ox-LDL誘導TF的表達。

葛根中的主要有效成分葛根素的化學名為4，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，具有多種藥理學作用[8-12]，其機制與PI3K/Akt/eNOS信號通路有關。臨床和實驗室研究發現，葛根素具有調節ACS患者外周血TF表達[13-14]、抑制血管緊張素Ⅱ誘導的TF表達[15]的作用。本實驗研究發現，葛根素能抑制ox-LDL誘導HUVECs TF mRNA和蛋白的表達；同時，葛根素減弱了ox-LDL對Akt的蛋白磷酸化抑制作用，使細胞內NO產生增加；而PI3K抑制物LY294002逆轉了葛根素的效應，細胞內TF mRNA和蛋白表達增高，Akt蛋白磷酸化減弱，NO產生減少；eNOS抑制劑L-NAME也取消了葛根素抑制ox-LDL對TF mRNA和蛋白表達的誘導作用，細胞內NO的產生也明顯減少。這些結果提示，葛根素通過上調PI3K/Akt/eNOS信號通路降低了ox-LDL對TF mRNA和蛋白表達的誘導作用。

總的來說，本研究進一步發現PI3K/Akt/eNOS信號通路可負調控ox-LDL誘導血管內皮細胞TF表達，而葛根素通過上調PI3K/Akt/eNOS信號通路降低了ox-LDL對TF mRNA和蛋白表達的誘導作用。

[1] Emekli-Alturfan E, Basar I, Alturfan AA, et al. The relation between plasma tissue factor and oxidized LDL levels in acute coronary syndromes[J]. Pathophysiol Haemost Thromb, 2007, 36(6):290-297.

[2] Breitenstein A, Tanner FC, Lüscher TF. Tissue factor and cardiovascular disease: quo vadis?[J] Circ J, 2010, 74(1):3-12.

[3] 劉紅利， 陳 檬， 王宏濤， 等.重組可溶性人CD40L誘導人臍靜脈內皮細胞損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(6):1111-1114.

[4] 鄧華菲， 任 重， 索 榮， 等. 外源性硫化氫對氧化型低密度脂蛋白誘導組織因子和組織因子途徑抑制物表達的影響[J]. 中國動脈硬化雜志， 2012, 20(9):769-772.

[5] Gebhard C, Holy EW, Camici GG, et al. Caffeine induces endothelial tissue factor expression via phosphatidylinositol 3-kinase inhibition[J]. Thromb Haemost, 2012, 107(5):884-894.

[6] Yang Y, Loscalzo J. Regulation of tissue factor expression in human microvascular endothelial cells by nitric oxide[J]. Circulation, 2000, 101(18): 2144-2148.

[7] Bao L, Zhang Y, Wei G, et al. The anti-atherosclerotic effects of puerarin on induced-atherosclerosis in rabbits[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 2015, 159(1):53-59.

[8] 黃 華， 丁 菁， 粟 鳳， 等. 葛根素預處理上調內皮型一氧化氮合酶的表達減輕人臍靜脈內皮細胞缺氧/復氧損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(5):857-862.

[9] Hwang YP, Kim HG, Hien TT, et al. Puerarin activates endothelial nitric oxide synthase through estrogen receptor-dependent PI3-kinase and calcium-dependent AMP-activated protein kinase[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2011, 257(1):48-58.

[10]Liu CM, Ma JQ, Sun YZ. Puerarin protects rat kidney from lead-induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 258(3):330-342.

[11]Wang Y, Wang WL, Xie WL, et al. Puerarin stimulates proliferation and differentiation and protects against cell death in human osteoblastic MG-63 cells via ER-dependent MEK/ERK and PI3K/Akt activation[J]. Phytomedicine, 2013, 20(10):787-796.

[12]Li Z, Shangguan Z, Liu Y, et al. Puerarin protects pancreatic β-cell survival via PI3K/Akt signaling pathway[J]. J Mol Endocrinol, 2014, 53(1):71-79.

[13]牛 玲， 李東野， 夏 勇， 等. 葛根素對急性冠狀動脈綜合征患者外周血組織因子和組織因子途徑抑制物含量的影響[J]. 中華臨床醫師雜志, 2010， 4(11):2269-2271.

[14]汪自龍， 李東野， 夏 勇， 等. 葛根素對急性冠脈綜合征患者體外單核源巨噬細胞MMP-9及TF的影響[J]. 江蘇中醫藥, 2008, 40(5):87-89.

[15]冉文卓， 王宏健， 廖曉紅， 等. 葛根素對AngII誘導HUVECs細胞組織因子表達的影響及其機制研究[J]. 中國現代醫學雜志, 2012, 22(12):13-18.

[16]Blum S, Issbruker K, Willuweit A, et al. An inhibitory role of the phosphatidylinositol 3-kinase-signaling pathway in vascular endothelial growth factor-induced tissue factor expression[J]. J Biol Chem, 2001, 276(36):33428-33434.

[17]Eto M, Kozai T, Cosentino F, et al. Statin prevents tissue factor expression in human endothelial cells: role of Rho/Rho-kinase and Akt pathways[J]. Circulation, 2002, 105(15):1756-1759.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in inhibitory effects of puerarin on ox-LDL-induced TF expression in vascular endothelial cells

DENG Hua-fei1, LI Jian1, ZHOU Qin1, TAN Yu-lin1, XIE Ming1, ZHANG Tian-jie1, HAN Ying1, ZHANG Wen-long2

(1BasicMedicalCollege,XiangnanUniversity,2DepartmentofNeurology,TheFirstPeopleHospitalofChenzhou,Chenzhou423000,China.E-mail:zhangwenlong72@126.com)

AIM: To explore the role of phosphatidylinositiol 3-kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase (PI3K/Akt/eNOS) signaling pathways in the inhibitory effects of puerarin on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced tissue factor (TF) expression in vascular endothelial cells. METHODS: The mRNA expression of TF was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The protein levels of TF and Akt was determined by Western blot. The content of the nitric oxide (NO) was measured by nitrate reduction method. RESULTS: Compared with control group, incubating endothelial cells with ox-LDL significantly induced TF expression at mRNA and protein levels and the dephosphorylation of Akt protein, and decreased NO production. Incubation of the endothelial cells with puerarin for 1 h and then treatment of the cells with ox-LDL decreased the TF expression at mRNA and protein levels, increased Akt protein phosphorylation and intracellular NO content. Co-incubation of the endothelial cells with PI3K inhibitor LY294002 and puerarin for 1 h and then treatment of the cells with ox-LDL augmented the TF expression at mRNA and protein levels and the Akt protein dephosphorylation, and decreased NO production. Co-incubation of the endothelial cells with eNOS inhibitorNG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and puerarin significantly decreased the inhibitory effect of puerarin on ox-LDL-induced TF expression at mRNA and protein levels in the endothelial cells, and reduced Akt protein phosphorylation and NO production. CONCLUSION: Puerarin inhibits ox-LDL-induced TF expression at mRNA and protein levels in the human umbilical vein endothelial cells via activation of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway.

Puerarin; Oxidized low-density lipoprotein; Tissue factor; PI3K/Akt/eNOS signaling pathway; Vascular endothelial cells

1000- 4718(2017)07- 1214- 05

2016- 12- 15

2017- 03- 13

湖南省教育廳資助科研項目(No. 13K113，11C1179)；湘南學院科研基金資助項目(No. 2015XB18)；湖南省衛生計生委科研計劃課題項目資助(No. B2017043)；湖南省重點建設學科資金資助項目(湘教發 [2011] 76 號)；湖南省郴州市科技局項目(No. [2011]29)；湘南學院重點建設學科資金資助項目(No. XNU-125-KD-019)

R965； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.010

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0735-2343191； E-mail： zhangwenlong72@126.com