黃芪通過抗氧化抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化*

歐陽燕， 陳小容， 鄭林鑫， 李 理， 李偉峰

(廣州軍區廣州總醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510010)

黃芪通過抗氧化抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化*

歐陽燕， 陳小容， 鄭林鑫， 李 理， 李偉峰△

(廣州軍區廣州總醫院呼吸內科， 廣東 廣州 510010)

目的： 研究黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠氧化/抗氧化水平的影響，探討黃芪抗纖維化的可能機制。方法: 將36只SPF級雌性昆明小鼠隨機分為對照組(生理鹽水氣管內霧化)、博萊霉素組(博萊霉素3 mg/kg氣管內霧化)和黃芪治療組(博萊霉素3 mg/kg氣管內霧化后黃芪注射液1.7 g·kg-1·d-1腹腔內注射)，實驗第14天收集小鼠肺組織及血清標本，取小鼠肺組織行HE和Masson染色；RT-PCR法測小鼠肺組織超氧化物歧化酶(SOD)1/2/3、過氧化氫酶(CAT)、NADPH氧化酶2/4(NOX2/4)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的mRNA水平；Western blot法測α-SMA和NOX2/4蛋白表達水平；比色法檢測血清丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)。結果: 博萊霉素組小鼠肺組織病理損傷較正常組明顯加重，α-SMA mRNA和蛋白表達，MDA/T-AOC，NOX2、NOX4和SOD3 mRNA表達，以及NOX2蛋白表達較正常組顯著上升，黃芪治療組則顯著逆轉上述改變；博萊霉素組小鼠NOX4蛋白表達較正常組顯著下降，而黃芪治療組較博萊霉素組顯著上升；博萊霉素組和黃芪治療組小鼠SOD1和CAT mRNA表達均較正常組顯著下降；SOD2 mRNA在3個組中表達的差異無統計學顯著性。結論: 黃芪能夠減緩博來霉素誘導的肺纖維化形成，其機制可能與調節氧化/抗氧化平衡有關。

黃芪； 肺纖維化； 氧化應激

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種主要累及肺間質、肺泡和(或)細支氣管的肺部彌漫性疾病，肺泡-毛細血管功能單位逐漸喪失，最終發展為彌漫性肺纖維化和蜂窩肺，治療手段非常有限，預后很差，死亡率高[1]。因此，深入探討其發病機制，尋求一種有效且副作用少的治療策略迫在眉睫。

中醫藥作為我國傳統醫學，副作用較少，在肺纖維化治療方面的研究越來越得到重視[2]。多個文獻報道黃芪具有抗氧化的作用[3-5]，但在抗肺纖維化方面的研究不多。我們推測，黃芪通過維持機體的氧化/抗氧化平衡，對緩解肺纖維化可能有一定作用。鑒此，本研究通過氣管內霧化博萊霉素制作肺纖維化小鼠模型，測定黃芪治療后小鼠血清丙二醛/總抗氧化能力比值(malondialdehyde/tatol antioxidant capacity，MDA/T-AOC)，肺組織NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)2/4、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)1/2/3和過氧化氫酶(catalase，CAT)mRNA表達，以及NOX2/4蛋白表達水平，探討黃芪減輕肺纖維化的可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物

8周齡SPF級雌性昆明小鼠，平均體重約29.3 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，飼養于廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。

2 主要材料

博萊霉素(浙江海正藥業)；黃芪注射液(正大青春寶藥業有限公司)；丙二醛測定試劑盒、總抗氧化能力測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol reagent (Invirtrogen)； 2× Taq Master Mix(康為世紀生物科技有限公司)；核酸Marker DL2000和PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)；RIPA強裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司)；蛋白酶抑制劑(Roche)；α-SMA抗體和β-actin抗體(武漢博士德公司)；NOX2抗體(北京博奧森公司)；NOX4抗體(Abcam)；化學發光劑(Billerica)；動物喉鏡、小鼠固定操作臺和MicroSprayereTM霧化器(PENN-CENTURY)；光學顯微鏡(Olympus)；NanoDrop 2000分光光度計和Multiskan Go 全波長酶標儀(Thermo Fisher)；凝膠成像系統(Bio-Rad)；Minichemi化學發光儀(北京賽智創業科技有限公司)。

3 方法

3.1 實驗設計 36只雌性昆明小鼠隨機分成正常組、博萊霉素組和黃芪治療組，每組12只。博萊霉素組小鼠腹腔注射水合氯醛后固定于小鼠固定操作臺，以小鼠喉鏡下壓小鼠舌根部，暴露聲門，Micro-SprayereTM霧化器吸取100 μL博萊霉素溶液(3 mg/kg溶于100 μL生理鹽水)從聲門插入小鼠氣道進行霧化，對照組霧化等體積生理鹽水，黃芪治療組在氣管內霧化博萊霉素后每日腹腔內注射100 μL黃芪注射液(1.7 g/kg稀釋至100 μL)，對照組和博萊霉素組小鼠每日腹腔內注射等體積生理鹽水。實驗第14天處死各組小鼠，眼球取血法獲取小鼠全血標本，3 000 r/min離心10 min獲得血清，解剖小鼠獲取肺組織標本。

3.2 小鼠肺組織病理改變的觀察 小鼠肺組織以10%中性甲醛固定72 h后常規脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色。參照Mikawar法[6]和Ashcroft法]7]對肺組織的炎癥損傷和纖維化損傷程度進行評分。

3.3 Western blot檢測小鼠肺組織α-SMA和NOX2/4的蛋白表達 取肺組織0.1 g，勻漿后抽提總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，每孔30 μg上樣進行SDS-PAGE，蛋白轉移至PVDF膜上。20 mL 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST洗滌液洗膜3次，每次10 min。加入α-SMA或NOX2/4 I 抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的 II 抗37 ℃孵育1 h。TBST洗膜 10 min、3次。化學發光試劑檢測蛋白印跡條帶，Gelpro32軟件分析結果。

3.4 小鼠血清MDA含量和T-AOC的檢測 取各組小鼠血清，嚴格按照南京建成生物工程研究所的MDA測定試劑盒和T-AOC測定試劑盒說明書進行操作，然后用Multiskan Go 全波長酶標儀(Thermo Fisher)測定吸光度A值，計算出各組小鼠血清MDA值和T-AOC值。

3.5 RT-PCR檢測小鼠肺組織NOX2/4、SOD1/2/3和CAT的mRNA表達 取小鼠肺組織100 mg剪碎，放入無RNA酶的預冷勻漿器中并加入1 mL TRIzol reagent，冰上進行勻漿處理，勻漿后提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計測各組小鼠肺組織所提取的RNA濃度并調整各組濃度為500 ng/μL ，進行RT-PCR反應。NOX2/4、SOD1/2/3、CAT及β-actin的上下游引物(Invitrogen)、退火溫度和循環數見表1，以β-actin為基準進行半定量分析。

4 統計學處理

用SPSS 19.0進行統計學處理。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織病理改變

肺組織HE染色：正常組小鼠肺組織結構清晰，肺泡壁薄，肺泡無明顯紅細胞及炎細胞浸潤；博萊霉素組小鼠肺組織出現彌漫性實變，肺泡壁明顯增厚，肺泡中出現大量炎細胞及少量紅細胞浸潤，肺間質出現較多成纖維細胞；黃芪治療組小鼠病理損傷程度居正常組及博萊霉素組之間。參照Mikawar法進行炎癥損傷評分，博萊霉素組炎癥損傷評分較正常組明顯升高(P<0.01),黃芪治療組炎癥損傷評分較博萊霉素組明顯下降(P<0.01)，見圖1。

表1 引物序列、退火溫度及循環數

F： forward； R: reverse.*depends on the annealing temperature of the target gene；**depends on the cycle of the target gene.

Figure 1.The severity of pulmonary inflammation in the mice (HE staining, ×200). BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus. Mean±SD.n=4 .**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsBLM group.

圖1 3組小鼠肺組織HE染色和肺組織炎癥損傷評分的比較

2 肺組織Masson染色

從圖2可見，正常組小鼠肺組織肺泡結構完整，無明顯炎細胞浸潤，無明顯膠原沉積；博萊霉素組小鼠肺組織結構紊亂，肺泡結構消失，出現大片彌漫性纖維化病灶和炎癥細胞浸潤，組織見大量藍色膠原沉積；黃芪組小鼠肺組織結構基本完整，肺泡壁輕中度增厚，有少量炎癥細胞浸潤和藍色膠原沉積。參照Ashcroft法進行炎癥損傷評分博萊霉素組纖維化損傷評分較正常組明顯升高(P<0.01),黃芪治療組纖維化損傷評分較正常組明顯升高(P<0.01)。

Figure 2.The severity of pulmonary fibrosis in the mice (Masson staining，×200).BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBLM group.

圖2 3組小鼠肺組織Masson染色和小鼠肺組織纖維化損傷評分的比較

3 小鼠肺組織α-SMA mRNA和蛋白表達的比較

博萊霉素組小鼠肺組織α-SMA的mRNA轉錄水平較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA的mRNA水平較博萊霉素組顯著降低(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA的mRNA轉錄水平與正常組無顯著差異。

此外，博萊霉素組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達水平較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA蛋白較博萊霉素組顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The expression of α-SMA at mRNA and protein levels in the mice. BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBLM group.

圖3 3組小鼠肺組織α-SMA mRNA和蛋白表達的比較

4 血清MDA/T-AOC值的變化

博萊霉素組小鼠血清MDA較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠MDA較博萊霉素組小鼠顯著降低(P<0.01)。

博萊霉素組小鼠血清T-AOC較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠T-AOC與博萊霉素組小鼠無顯著差異，黃芪治療組小鼠T-AOC較正常組顯著上升(P<0.05)。

博萊霉素組小鼠血清MDA/T-AOC值較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠MDA/T-AOC較博萊霉素組小鼠顯著降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The serium MDA/T-AOC in the mice. BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBLM group.

圖4 3組小鼠血清MDA/T-AOC的比較

5 小鼠肺組織NOX2/4、SOD1/2/3和CAT mRNA水平的變化

與正常組比較，博萊霉素組小鼠肺組織NOX2和NOX4的mRNA水平顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織NOX2 和NOX4的mRNA水平較博萊霉素組組明顯下降(P<0.01)。

博萊霉素組小鼠肺組織SOD1的mRNA水平較正常組顯著降低(P<0.05)，黃芪治療組小鼠肺組織SOD1的mRNA轉錄水平與博萊霉素組無顯著差異，正常組、博萊霉素組、黃芪治療組小鼠肺組織SOD2的mRNA轉錄水平的差異無統計學顯著性。

博萊霉素組小鼠肺組織SOD3 mRNA水平較正常組顯著升高(P<0.05)，黃芪治療組小鼠肺組織SOD3 mRNA轉錄水平較博萊霉素組顯著降低(P<0.05)。

博萊霉素組小鼠肺組織CAT mRNA轉錄水平較正常組顯著降低(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織CAT mRNA轉錄水平較博萊霉素組顯著降低(P<0.01)，見圖5、表2。

Figure 5.The mRNA expression of NOX2/4,SOD1/2/3,CAT in the mice. BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus.

圖5 三組小鼠肺組織NOX2/4、SOD1/2/3和CAT mRNA水平的比較

表2 3組小鼠肺組織NOX2/4、SOD1/2/3和CAT mRNA水平的比較

BLM： bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsBLM group.

6 小鼠肺組織NOX2/4蛋白表達水平的變化

博萊霉素組小鼠肺組織NOX2蛋白表達水平較正常組顯著升高(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織NOX2 蛋白表達水平較博萊霉素組明顯下降(P<0.01)。博萊霉素組小鼠肺組織NOX4蛋白表達水平較正常組顯著降低(P<0.01)，黃芪治療組小鼠肺組織NOX4蛋白表達水平較博萊霉素組顯著升高(P<0.05)，見圖6。

討 論

本研究以博萊霉素氣管內霧化制作肺纖維化小鼠模型，以1.7 g/kg的黃芪注射液腹腔內注射進行干預，HE和Masson染色顯示黃芪能下調博萊霉素所誘導的肺纖維化小鼠模型肺部的炎癥損傷評分和纖維化損傷評分，RT-PCR和Western blot實驗結果顯示黃芪能下調博萊霉素誘導的肺纖維化中肺成纖維細胞、肌成纖維細胞的生物學標志物α-SMA的高表達，這表明黃芪能緩解博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化。

Figure 6.The protein expression of NOX2/4 in the mice. BLM：bleomycin； AM：Astragalusmembranaceus. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBLM group.

圖6 3組小鼠肺組織NOX2/4蛋白表達量的比較

氧化/抗氧化失衡導致結構細胞氧化損傷是肺纖維化重要發病機制之一[9]。活性氧除引起氧化損傷外，還可以激活纖維化相關的信號通路，引起肺結構細胞異常增生、新生血管生成、細胞外膠原沉積等纖維化改變。T-AOC是機體各種抗氧化大分子、小分子和酶的總水平，可反映機體清除活性氧簇(reactive oxygen species， ROS)的能力，是反映體內抗氧化能力的較好指標。MDA為ROS誘導脂質過氧化反應的主要代謝產物，測量它的含量間接反映了組織內ROS的生成量。本研究顯示博萊霉素組小鼠血清MDA/T-AOC較正常組明顯升高，而黃芪治療組小鼠血清MDA/T-AOC水平較博萊霉素組明顯下降，與正常組無顯著差異，提示黃芪抑制博來霉素致小鼠肺纖維化的作用與維持機體內氧化/抗氧化平衡密切相關。從MDA和T-AOC在3組小鼠中的比較可見，黃芪維持小鼠體內氧化/抗氧化平衡主要與下調MDA，發揮抗氧化作用，使小鼠的氧化損傷降低相關，其抗氧化作用，除對結構細胞有直接保護作用外，還打斷氧化應激損傷-細胞過度增生、異常修復的正反饋環路，從而達到遏制肺纖維化發展。

ROS 主要由NOX催化產生[10]，NOX 包括 NOXl、 NOX2、 NOX3、 NOX4、NOX5、DUOXl 和 DUOX2，其中與器官纖維化相關的主要是NOX2和NOX4[10-11]。NOX2和NOX4都屬于NADPH氧化酶家族，NOX2與NOX1、NOX3結構上的相似性很高，但與NOX4僅有39%的相似性，結構的差異決定了其功能上的不一致[14]。本研究實驗結果顯示，在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化中，博萊霉素組小鼠肺組織NOX2/4的mRNA轉錄均較正常組顯著上升，NOX2的蛋白表達較正常組顯著上升，而NOX4蛋白較正常組顯著下降，最初研究認為NOX酶只在單核巨噬細胞和中性粒細胞中表達分泌，而最近研究表明NOX酶在非吞噬細胞中也有表達分泌，而且具有組織和細胞特異性，肺組織中主要表達和分泌NOX2和NOX4，其中NOX2主要由巨噬細胞和其它吞噬細胞表達分泌，與肺部許多疾病密切相關，而NOX4在上皮細胞中表達分泌，可能與肺部的防御功能有關[12-13]。我們推測在博萊霉素誘導小鼠形成肺纖維化過程中，肺組織出現了嚴重的氧化損傷，伴有大量炎細胞浸潤及上皮細胞破壞，大量浸潤的炎細胞使NOX2/4的mRNA，NOX2蛋白表達水平上升，NOX2蛋白酶能催化產生大量ROS，大量的ROS通過直接損傷DNA、脂質、蛋白質等破壞肺組織的結構細胞或通過調節信號通路使肺結構細胞異常增殖，從而促進了肺纖維化的發生[14]，而表達分泌NOX4蛋白的肺泡上皮細胞遭受大量破壞，NOX4蛋白表達分泌減少。黃芪注射液能調節博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠機體氧化/抗氧化水平的平衡，下調NOX2/4 mRNA的轉錄和NOX2蛋白表達，發揮抗氧化作用，減輕炎細胞浸潤。同時，其對肺泡上皮細胞的保護作用使NOX4蛋白的表達分泌得到部分恢復。

機體內消除ROS的抗氧化酶類包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶系統等，其中超氧化物歧化酶有3種同功酶分別是胞質超氧化物歧化酶、線粒體超氧化物歧化酶、胞外超氧化物歧化酶[15]。有研究表明，當心臟被短暫的缺血預處理后，SOD2活性和含量較處理前升高, SOD1、CAT活性及含量則沒有明顯變化，而在糖尿病大鼠模型心肌中，SOD2含量和活性明顯降低, SOD1蛋白含量則出現代償性增加, 從而提高了組織抗氧化的能力[16]。在燒傷的大鼠肺組織中，燒傷后6 h SOD1表達較對照組明顯升高，但燒傷后12 h SOD1表達則較燒傷后6 h 明顯下降，燒傷后6 h 50%面積燒傷的大鼠SOD1表達較30%面積燒傷的大鼠明顯下降，而SOD2的表達則不隨燒傷時間和燒傷面積發生改變[17]

以上多個研究表明，在不同疾病時相的不同病理狀態中，SOD各同工酶的轉錄和表達存在不一致，一些物質還會引起SOD同工酶的表達或活性改變[16, 18-19]。本研究結果顯示，博來霉素誘導的肺纖維化中，SOD3的mRNA表達明顯上調，SOD1和CAT的mRNA則較正常組減弱，黃芪干預后，三者表達量均較博來霉素組明顯下調，而SOD2表達在各組間未見明顯差異。我們認為，SOD1、SOD3和CAT都不同程度地參與了博來霉素誘導的氧化反應的活性氧清除過程，而SOD1、CAT表達高峰可能在14 d 前(本研究造模時間為14 d)，隨后失代償回落。黃芪干預后，小鼠體內過度的氧化應激反應被打斷，活性氧減少，抗氧化物質隨之下降，氧化/抗氧化平衡恢復，故上述三者的表達量均進一步降低。SOD2 mRNA的在3組小鼠中無顯著變化，提示SOD2可能未參與博來霉素誘導的小鼠肺纖維化氧化損傷過程中活性氧的清除。

綜上所述，黃芪具有顯著的抗氧化作用，能緩解博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化。其機制與遏制博來霉素導致結構細胞氧化損傷，維持氧化/抗氧化平衡密切相關。黃芪抗氧化、抗纖維化機制的研究，為黃芪在IPF治療中的應用提供了有用的實驗室依據，為臨床應用奠定基礎，進一步研究黃芪中抗纖維化的有效和確切成分并將之分離提純，有望為IPF的治療提供新的策略。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Astragalusmembranaceusinhibits bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by antioxidation

OU-YANG Yan, CHEN Xiao-rong, ZHENG Lin-xin, LI Li, LI Wei-feng

(DepartmentofRespiratoryMedicine,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China.E-mail:lwf980622@126.com)

AIM: To investigate the effect ofAstragalusmembranaceuson the balance of oxidation and antioxidation in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice and the possible anti-fibrosis mechanism ofAstragalusmembranaceus. METHODS: Female KM mice (n=36) were randomly divided into 3 groups. The mice in control group were administered with saline aerosol intratracheally. The mice in fibrosis group were administered with bleomycin at dose of 3 mg/kg aerosol intratracheally. The mice inAstragalusmembranaceusgroup were administered with bleomycin at dose of 3 mg/kg aerosol intratracheally and then intraperitoneal injected withAstragalusmembranaceusparenteral solution at daily dose of 1.7 g/kg. All mice were sacrificed 14 d after the treatment, and the lungs and serum were collected for detection. Hematoxylin-eosin staining was performed in the lung tissue. The mRNA expression of superoxide dismutase 1/2/3 (SOD1/2/3), catalase (CAT), NADPH oxidase 2/4 (NOX2/4) and α-smooth muscle actin (α-SMA) was detected by RT-PCR， and the protein expression of α-SMA and NOX2/4 was determined by Western blot. The concentration of malondialdehyde (MDA) and total antioxidant capacity (T-AOC) in the serum were measured by a colorimetric method. RESULTS: The pathological injury was obviously observed in bleomycin group compared with control group， but was attenuated inAstragalusmembranaceusgroup. The α-SMA mRNA and protein expression, MDA/T-AOC, NOX2, NOX4 and SOD3 mRNA expression, and NOX2 protein expression in bleomycin group were significantly higher than those in control group, while those inAstragalusmembranaceusgroup were significantly lower than those in bleomycin group. The protein expression of NOX4 in bleomycin group was significantly lower than that in control group, while that inAstragalusmembranaceusgroup was higher than that in bleomycin group. The mRNA expression of SOD1 and CAT inAstragalusmembranaceusgroup and bleomycin group were decreased compared with control group. No significant difference of SOD2 mRNA expression among the 3 groups was observed. CONCLUSION:Astragalusmembranaceusinhibits bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice by maintaining the balance of oxidation and antioxidation.

Astragalusmembranaceus; Pulmonary fibrosis; Oxidative stress

1000- 4718(2017)07- 1271- 07

2016- 10- 24

2017- 03- 27

廣東省建設中醫藥強省科研課題資助項目(No. 20131135)；廣東省醫學科學技術研究基金項目(No. 2015116232124943)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313596)；廣州市科技計劃項目(No. 201607010310)；廣東省自然科學基金資助項目(No. S2011010000511)

R285.5； R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.019

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