蜂膠黃酮PB3A作用下結腸癌細胞株中miRNA-198和miRNA-296-5p的表達及功能預測*

胡尼其古麗·阿巴克， 瑪依努爾·達吾提， 依米提·熱合曼， 阿依努爾·玉蘇普， 吾熱婭提古麗·克維爾， 買日江古麗·阿布力提甫

(新疆大學生命科學與技術學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

·短篇論著·

蜂膠黃酮PB3A作用下結腸癌細胞株中miRNA-198和miRNA-296-5p的表達及功能預測*

胡尼其古麗·阿巴克， 瑪依努爾·達吾提， 依米提·熱合曼△， 阿依努爾·玉蘇普， 吾熱婭提古麗·克維爾， 買日江古麗·阿布力提甫

(新疆大學生命科學與技術學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

目的： 探討蜂膠黃酮短葉松素-3-乙酸酯(pinobanksin-3-acetate，PB3A)對結腸癌SW480細胞微小RNA(microRNA, miRNA)表達譜的影響，為結腸癌的治療及靶向藥物研發提供理論依據。方法: 使用miRNA芯片技術分析檢測蜂膠黃酮PB3A處理人類結腸癌SW480細胞后miRNA表達譜的變化。通過實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-198和miRNA-296-5p的表達水平，以此來驗證miRNA芯片結果的準確性和可靠性。利用miRWalk、MicroT、miRanda等12個網上數據庫預測這2條miRNAs的靶基因并進行靶基因功能富集分析。結果: miRNA芯片分析結果顯示，蜂膠黃酮PB3A干預24 h后結腸癌SW480細胞中差異表達倍數在2倍及以上的miRNA有267條，其中差異表達倍數達10倍及以上的miRNA有30條，28條為上調表達，2條下調表達；RT-qPCR實驗結果顯示miRNA-198和miRNA-296-5p的表達量趨勢跟miRNA芯片結果一致，表達差異有統計學意義(P<0.05)。miRNA靶基因預測發現miRNA-198有859個靶基因，miRNA-296-5p有906個靶基因；對這些可能被調控的靶基因進行Gene Class分析，結果顯示miRNA-198和miRNA-296-5p的靶基因功能主要為轉錄因子、拷貝數變異、細胞分化、癌基因、蛋白激酶、組蛋白、轉移癌基因、腫瘤抑制基因等(P<0.05)。信號通路富集分析結果顯示，miRNA-198靶基因顯著富集于腫瘤通路、Wnt信號通路、胞吞通路、ErbB信號通路、黏著斑通路、黑素生成通路等信號通路，而miRNA-296-5p靶基因在MAPK信號通路、胞吞通路、軸突導向通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路、鈣離子信號通路等信號通路中出現聚集(P<0.05)。結論: 蜂膠黃酮PB3A 影響結腸癌SW480細胞的miRNA表達譜。PB3A作用下miRNA-198和miRNA-296-5p的異常表達可能參與PB3A抗結腸癌的過程。

短葉松素-3-乙酸脂； 結腸癌SW480細胞； 微小RNA-198； 微小RNA-296-5p

結腸直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是消化系統最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率占全球癌癥的10%，在男性中排第3位，女性中排第2位[1]。目前，結腸癌在我國的發病率越來越高，對人們身體健康帶來嚴重威脅，其在我國胃腸道腫瘤中的致死率排第4位，發病率排第3位，城市地區的發病率比農村地區高[2]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于多種生物體內的長度約18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA[3]。microRNA突變、缺失或表達水平的異常與人類腫瘤密切相關，它具有癌基因樣或抑癌基樣作用，因此促進或抑制腫瘤的發生、發展[4]。據報道，已有100多種 miRNA在結腸癌組織和細胞中特異性表達[5]，在結腸癌上最初被發現異常表達的miRNA是miR-145和miR-143[6]。

蜂膠黃酮短葉松素-3-乙酸脂(pinobanksin-3-acetate，PB3A)是一種黃色，溶于二甲亞砜的，從蜂膠、蜂蜜及某些植物花苞等分離純化獲得的一種二氫黃酮化合物。本實驗室前期研究發現PB3A通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡而發揮抗癌作用，它對大腸癌HCT116細胞[7]及SW480細胞[8]、胃癌SGC-7901細胞[9]和人肝癌HepG-2細胞[10]有抑制增殖和誘導凋亡作用。然而miRNA在蜂膠黃酮PB3A抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡中的調控作用及其相關分子機制，國內外向未報到。本研究通過觀察PB3A對結腸癌SW480細胞miRNA表達譜的影響，有望豐富PB3A的抗癌作用機制，為其進一步開發成為有效治療結腸癌藥物提供實驗依據，并為以miRNA為靶點的新型抗癌藥物的開發提供新的策略和思路。

材 料 和 方 法

1 材料

PB3A，質量分數>99%，由Yasuyuki T教授(日本千葉工業大學)和依米提·熱合曼博士提供。SW480細胞株購自上海細胞庫。

2 主要試劑

MTT試劑和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma； RPMI-1640培養基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；TRIzol總RNA提取試劑，miRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司；miRNA表達譜芯片由上?？党缮锕こ逃邢薰緳z測。

3 主要方法

3.1 細胞培養及藥物干預 結腸癌SW480細胞給含有10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640完全培養基，在含有5% CO2的恒溫培養箱內培養。隔2～3 d當細胞融合率達80%～90%時換新的培養基，細胞進入對數生長期后可用于實驗。取對數生長期的細胞，以每孔3×107個接種于6孔培養板培養，24 h后吸除原培養基。本實驗室前期研究結果顯示蜂膠黃酮PB3A對結腸癌SW480細胞具有較強的誘導凋亡的作用，根據前期研究結果，我們選擇濃度為100 mg/L PB3A干預結腸癌SW480細胞24 h作為miRNA芯片處理條件：設每孔加入2 mL含有濃度為100 mg/L PB3A(母液是用DMSO稀釋的)的RPMI-1640培養液混合培養組為實驗組，培養液中不加藥物(加相同濃度的DMSO，DMSO濃度≤0.5%)為對照組，繼續培養24 h后收集細胞。

3.2 細胞總RNA的提取及質量鑒定 SW480細胞用PB3A處理24 h后采用Trizol試劑提取總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度,并以1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

3.3 miRNA芯片 將達到實驗要求的細胞總RNA，反轉錄合成熒光分子Hy3標記的cDNA探針，與miRCURY LNATMArray (Exiqon)芯片雜交，利用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner進行掃描，利用GenePix Pro 6.0軟件讀取圖片原始強度并進行分析。差異表達的miRNA通過倍數變化篩選鑒定，差異miRNA篩選標準為實驗組和對照組信號差異比值≥2和≤0.5。

3.4 RT-qPCR實驗 取100 ng總RNA，使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對miRNA 3’末端進行加poly(A)處理，然后用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應， 合成miRNA對應cDNA第一鏈。下一步使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進行定量PCR檢測。20 μL體系，PCR反應條件： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 20 s， 60 ℃ 34 s，共40循環。以U6作為內參照，所有樣品設3個重復。以2-ΔΔCt法分析miRNA的相對表達量。

3.5 差異表達miRNA生物信息學分析 利用miRWalk、MicroT、miRanda、miRBridge、miRDB、miRmap、miRNAMap、PicTar、PITA、RNA22、RNAhybrid以及TargetScan等12個算法或數據庫對miRNA芯片結果中差異表達倍數≥10的miR-198和miR-296-5p進行靶基因預測，至少要在7個算法或數據庫均預測到才算有效靶基因。然后應用Fisher Exact檢驗對這些可能被調控的靶基因進行Gene Class、GO分析及KEGG信號通路分析/富集分析，從多個功能角度探索microRNA-靶基因-功能間的關系并統計富集結果。

4 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差(mean±SD)表示。藥物干預和非干預組之間miRNA的ΔCt值比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞總RNA純度及濃度測定

用超微量分光光度計檢測100 mg/L PB3A 干預24 h候后提取的細胞總RNA濃度和純度，結果顯示其A260/A280值>1.8；經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，結果28S和18S兩條電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1。此結果說明提取的總RNA完整性好，質量符合表達譜芯片實驗要求，可用于后續實驗。

2 PB3A對miRNA表達譜的影響

對所得的miRNA表達芯片掃描圖像進行數字化處理和分析，結果發現，PB3A 作用24 h后實驗組與對照組比較，結腸癌SW480細胞中267條miRNA表達有顯著性差異，其中218條miRNA上調表達，49條miRNA下調表達，差異倍數(fold change)≥2和≤0.5；差異倍數≥10的上調表達的miRNA 有28條，差異倍數≤0.1的下調表達的miRNA 有2條，見表1。

表1 PB3A處理組及對照組SW480細胞中差異表達倍數10倍及以上的miRNA

3 通過RT-qPCR實驗檢測miRNA-198和miRNA-296-5p在結腸癌SW480細胞株中的表達情況，對miRNA芯片結果進行驗證

用100 mg/L PB3A處理結腸癌SW480細胞株24 h后，藥物處理組miRNA296-5p和miRNA-198表達上調，與藥物未干預組相比有顯著差異(P<0.01)，見圖1；本實驗中miRNA296-5p的相對表達量差異倍數2-ΔΔCt值為4.47，miRNA-198的相對表達量差異倍數2-ΔΔCt值為2.74，表達差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2，該表達情況與miRNA 芯片的檢測結果一致。

Figure 1.Differential expression levels of miRNAs in drug-treated and untreated SW480 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖1 藥物處理與未處理SW480細胞中miRNA的差異表達水平

Figure 2.Validating the results of microarray miRNA expression by RT-qPCR.

圖2 RT-qPCR驗證miRNA表達量并與miRNA芯片結果對比

4 miRNA-198和miRNA-296-5p靶基因的預測及生物學功能分析

采用miRWalk、MicroT、miRanda、miRBridge以及TargetScan等12個數據庫對這2條miRNAs的靶基因進行預測，選擇7個或以上數據庫出現的靶基因，結果顯示miRNA-198有859個靶基因，miRNA-296-5p有906個靶基因。下一步通過Fisher Exact檢驗對這些可能被調控的靶基因進行Gene Class、GO分析及KEGG信號通路分析/富集分析，發現miRNA-198和miRNA-296-5p的靶基因基因功能主要涉及轉錄因子、拷貝數變異、細胞分化、癌基因、蛋白激酶、組蛋白、轉移癌基因、腫瘤抑制基因等(P<0.05)。隨后將這些基因分別投射至GO分析的細胞組分、分子功能和生物學過程三大應用功能上，miR-198分別得到90條、 94條及213條相關注釋描述, 主要參與細胞質、細胞核、高爾基體、細胞連接、核仁、內質網膜、質膜組成部分、高爾基膜等細胞組分形成；與蛋白結合、ATP結合、鋅離子結合、蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶結合、GTP酶激活活性、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子活性、轉錄因子結合及金屬離子結合等分子功能密切相關；主要與小G蛋白介導的信號轉導調控、軸突導向、轉錄依賴性DNA的正調控、RNA聚合酶II啟動子的轉錄調控、轉錄DNA依賴性蛋白質轉運、細胞內信號轉導、跨膜運輸、神經生長因子受體信號通路、細胞增殖的負調控、神經系發展等生物過程有關。miR-296-5p分別得到106條、115條及248條相關注釋描述, 主要參與細胞胞質細胞核、高爾基體、細胞連接、核仁、內質網膜、質膜組成部分、高爾基膜、胞核周區、突觸、細胞質囊泡膜等組分形成；主要分子功能與蛋白結合、序列特異性DNA結合轉錄因子活性、ATP結合、鋅離子結合、相同的蛋白結合、蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶活性、β-連環蛋白結合等有關；與神經生長因子受體信號通路跨膜轉運、轉錄DNA依賴、正調節轉錄DNA依賴、蛋白磷酸化、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調節、小GTPase介導的信號轉導、調節小腸介導的信號轉導、調節轉錄DNA依賴表皮生長因子受體信號通路等密切相關。在GO分析注釋分類的基礎上，采用已有生物通路數據，對這2條miRNA的靶基因進行生物通路富集分析。結果顯示，在通路數據庫KEGG中miRNA-198富集于腫瘤通路(35)、Wnt信號通路(27)、胞吞通路(23)、ErbB信號通路(17)、黏著斑通路(23)和黑素生成通路(17)等重要的信號通路中； 而miRNA-296-5p在MAPK信號通路(41)、胞吞通路(24)、軸突導向通路(17)、Wnt信號通路(17)、胰島素信號通路(15)、鈣離子信號通路(21)、黑素生成通路(17)、磷脂酰肌醇信號系統(11)、黏著斑通路(18)和ErbB信號通路(13)等信號通路出現聚集。

討 論

結腸癌是一種早期階段診斷較難，預后較差的，嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，據報道2015年結腸癌在我國發病率和致死率在所有腫瘤中排第5位[11]。目前治療該癌最多應用的是化療，但因為化療藥物的副作用、癌細胞對藥物的耐藥性等原因，治療結果不太理想。雖然最近在結腸癌診斷及治療方面獲得了不少成就，但為了提高治療效率和診斷的精確性發現新的治療靶點和預后指標仍然是一個研究重點。miRNA是一種轉錄后水平調節基因表達的非編碼RNA，它的異常表達會影響靶基因發揮正常功能，從而引起其靶基表達的改變，參與個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動[12]。據報道超過50%的 miRNAs 位于腫瘤相關的基因組區域或脆性位點，其異常表達有關于腫瘤發生和發展[13]。研究發現多種miRNA參與結腸癌的發生和發展，miRNA-381在結腸癌中下調表達，其下調表達能促進結腸癌增殖和侵襲[14]。下調表達的miRNA-132也能促進結腸癌的發展,可作為結腸癌患者預后的指標[15]。研究還發現過表達的miRNA-128[16]和miRNA-34a[17]可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。上調表達的miRNA-139-5p能抑制細胞增殖和轉移，并且靶向致癌基因NOTCH1促進細胞凋亡和細胞周期停滯而在結腸癌中起關鍵作用[18]。蜂膠黃酮PB3A對結腸癌細胞具有抑制增殖和誘導凋亡作用[8]，本研究中我們通過miRNA芯片技術檢測蜂膠黃酮PB3A處理前后SW480細胞中miRNA表達量變化，探討miRNA在蜂膠黃銅PB3A抗癌作用中起的作用。

根據前期研究結果[8]我們選擇了PB3A濃度100 mg/L、處理時間 24 h 為miRNA芯片分析的處理條件， 觀察PB3A處理前后SW480細胞中miRNA 表達譜的變化，發現藥物處理后結腸癌SW480細胞內267條miRNA表達量發生顯著差異。這些PB3A相關差異表達的 miRNAs 中上調表達的miRNA-198(差異倍數69.59223)和miRNA-296-5p(差異倍數33.35)通過RT-qPCR實驗檢測表達情況時，結果與miRNA芯片結果一致，表明PB3A對結腸癌細胞miRNA表達量有影響。

研究發現在前列腺癌中miRNA-296-5p通過直接靶向Pin1抑制細胞增殖和非依賴性生長[19]。在非小細胞肺癌中miRNA-296-5p通過直接靶向 PLK1，調節其表達起腫瘤抑制作用[20]。Elfimova等[21]研究結果顯示miRNA-198充當腫瘤抑制基因通過鎮壓有絲分裂和無絲分裂通路遞減肝癌細胞生長和遷移。在大腸癌中miRNA-198表達下調，其下調顯著與大腸癌嚴重程度有關。它通過以FUT8為靶點抑制大腸癌增殖和侵襲[22]。又有研究發現miRNA-198在體內和體外以SHMT1為靶點抑制肺癌細胞增殖[23]。

miRNA是通過調控其靶基因表達而發揮作用的，因此我們首先預測了這2條miRNAs的靶基因，預測結果顯示miRNA-198有859個，miRNA-296-5p有906個靶基因。所以下一步為了探究miRNA-296-5p和miRNA-198在結腸癌細胞內起的作用對它們的靶基因進行功能富集分析。Gene Class分析發現，這2條miRNA靶基因的主要功能聚集轉錄因子，拷貝數變異，細胞分化，癌基因，蛋白激酶，組蛋白，轉移癌基因，腫瘤抑制基因等方面。進行KEGG通路分析發現miRNA-198在腫瘤通路、Wnt信號通路、胞吞通路、ErbB信號通路、黏著斑通路、黑素生成通路等信號通路中，miRNA-296-5p在MAPK信號通路、胞吞通路、軸突導向通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路、鈣離子信號通路等信號通路中出現聚集。這2條miRNAs靶基因的轉錄因子、拷貝數變異、細胞分化等基因功能在癌癥發生和發展中起重用，并且這些靶基因參與腫瘤通路、Wnt信號通路、MAPK 信號通路、胞吞通路、ErbB信號通路、鈣離子信號通路等腫瘤發生與發展密切相關的信號轉導途徑，提示miRNA-296-5p和miRNA-198通過靶向調控其靶基因在PB3A抗腫瘤作用中起重要的作用。

本研究確認了結腸癌細胞中蜂膠黃酮PB3A作用下miRNA-198和miRNA-296-5p會差異表達，并預測了這2個miRNA靶基因和相應靶基因在結腸癌中可能的作用。這為今后的通過miRNA診斷和治療結腸癌提供更豐富的資料。但這些應用生物信息學分析而獲得的結果還需要通過進一步靶基因功能驗證來確認。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of miRNA-198 and miRNA-296-5P in PB3A-treated colon cancer cell line and its function prediction

Ghunichigul ABAQ, Maynur DAWUT, Yimit RAHMAN, Aynur YUSUP, Wureyatiguli KEWEIER, Marjangul ABLITIP

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China.E-mail: 3081599679@qq.com)

AIM: To explore the effect of pinobanksin-3-acetate (PB3A) on microRNA (miRNA) expression profile of human colon cancer cells for providing new methods of treatment of colon cancer and development of targeted drug. METHODS: The method of miRNA expression profiling was used to observe the miRNA differential expression in human colon cancer SW480 cells after treated with PB3A. The expression of miRNA-198 and miRNA-296-5p in the SW480 cells was detected by RT-qPCR. The network databases of miRWalk， MicroT, miRanda and so on were used to predict the target genes regulated by these miRNAs， and pathway significant enrichment analysis was performed. RESULTS: miRNA microarray analysis showed that after treated with propolis flavonoid PB3A for 24 h, 267 miRNAs with differential expression twice or more in the SW480 cells were observed. Among them, there were 30 miRNAs with 10-fold or more differential expression, in which 28 were up-regulated and 2 were down-regulated. The results of RT-qPCR showed that the expression levels of miRNA-198 and miRNA-296-5p were consistent with the results of miRNA microarray analysis, and the difference was statistically significant (P<0.05). Bioinformatic analysis revealed that miRNA-198 has 859 target genes, and miRNA-296-5p has 906 target genes. The target genes of miRNA-198 were clustered in pathways in cancer, axon guidance, Wnt signaling pathway, regulation of actin cytoskeleton, insulin signaling pathway and MAPK signaling pathway, while the target genes of miRNA-296-5p were clustered in axon guidance, Wnt signaling pathway, MAPK signaling pathway, endocytosis， melanogenesis, insulin signaling pathway and calcium signaling pathway. CONCLUSION: Propolis flavonoid PB3A affects the expression of miRNA in colon cancer SW480 cells. The abnormal expression of miRNA-198 and miRNA-296-5p may be involved in the inhibitory effect of PB3A on colon cancer.

Pinobanksin-3-acetate; Colon cancer SW480 cells; MicroRNA-198; MicroRNA-296-5p

1000- 4718(2017)07- 1317- 06

2016- 12- 05

2017- 03- 31

國家自然科學基金資助項目(No. 31660333)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.027

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