幽門螺桿菌感染對人牙齦組織細胞凋亡的影響

黃 珊， 賴仁發， 鐘麗珍

(暨南大學附屬第一醫院口腔科，廣東 廣州 510632)

幽門螺桿菌感染對人牙齦組織細胞凋亡的影響

黃 珊， 賴仁發△， 鐘麗珍

(暨南大學附屬第一醫院口腔科，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察正常牙齦組織中幽門螺桿菌(Hp)的感染情況及其對人牙齦組織細胞凋亡的影響。方法: 采用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測30例健康牙齦組織中Hp感染情況，應用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測牙齦組織中的細胞凋亡指數，分析Hp對牙齦組織的毒性作用。結果: PCR檢測的30名患者，Hp陽性率為40%。在TUNEL結果中，可見Hp陽性組有大量棕色凋亡細胞，部分細胞核固縮成團或核膜周圍邊集成環狀。而正常對照組中陽性凋亡細胞較Hp感染組明顯偏低，2組細胞凋亡指數差異有統計學意義。結論: Hp感染可能是引起牙齦組織細胞凋亡的因素之一。

牙齦組織； 幽門螺桿菌； 細胞凋亡

牙周炎是發生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，可導致口腔異味、牙松動移位、甚至牙脫落等并發癥狀，嚴重影響患者的生活質量。現代醫學認為牙菌斑是引發該疾病的始動因子，通過毒力因子或介導不同介質引起牙周組織細胞凋亡、壞死等形態與性質的異常。由于口腔與胃腸道同屬消化系統，其黏膜性狀多有相似之處，而幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃腸道的重要致病菌，近些年在口腔牙周袋內也多次分離檢測到。因此，不少文獻推測口腔幽門螺桿菌與牙周組織致病相關。Sudhakar等[1]研究顯示口腔衛生差的患者，牙菌斑內Hp的陽性率顯著增高。2010年，Song等[2]檢測42名消化系統不適的患者口腔多部位Hp，發現牙菌斑中Hp 陽性率可達97%。然而，由于口腔Hp相對濃度較低，僅在齦溝液、唾液或牙菌斑中取樣檢測有一定難度，且隨著取樣位點的不同，其陽性率也多有不同。因此，常有與以上研究矛盾的結果出現。甚至有學者認為，幽門螺桿菌是口腔的正常菌群之一，并無治療的意義[3]。幽門螺桿菌的口腔致病性還在爭議中。本實驗通過比較Hp感染情況及Hp陽性與陰性兩組牙齦組織的細胞凋亡指數，推測Hp的存在是否對牙周組織產生影響。

材 料 和 方 法

1 儀器與試劑

脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；烤箱(上海福瑪實驗儀器有限公司)；水浴鍋(天力醫療器械有限公司)；脫色搖床(北京市六一儀器廠)；渦旋混合器(天悅電子)；倒置熒光顯微鏡和成像系統(Nikon)；ABI9700 PCR擴增儀(ABI)；TUNEL試劑盒(Roche)

其它：無水乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、破膜液、雙氧水、甲醇、蘇木素染液、鹽酸、氨水、中性樹膠、DAB顯色劑等均為國產產品。

2 標本來源

選擇2016年9月～2017年2月暨南大學附屬第一醫院口腔科因牙折須行冠延長手術的患者30例，男12例，女18例，年齡25～40歲。納入標準:(1)牙周探診深度<3 mm，無附著喪失和明顯炎癥存在；(2)X線片示無牙槽骨吸收。排除標準:3個月內服用抗生素及鉍劑或質子泵抑制劑等胃藥者及患有其它全身性系統疾病者。

進行冠延長的患者局麻下切除頸圈2 mm以上牙齦組織送檢。每個樣本切斷成2份。1份直接放入高溫消毒過的無菌Eppendorf管中，-70 ℃冰箱保存備用，進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)；1份經中性甲醛液常溫下固定，用于TUNEL檢測。

3 實驗方法

3.1 PCR技術檢測牙齦組織Hp (1)DNA 提取：將實驗樣品和10 μL PK Solution、200 μL Lysis Buffer于離心管混合，振蕩5～10 s；56 ℃溫浴10 min；加入200 μL無水乙醇，充分振蕩混勻5～10 s；將混勻的液體轉移至一只套有收集管的Spin column上。8 000×g離心1 min，棄去套管內的液體；加入500 μL WB Buffer，10 000×g離心60秒；加入700 μL Wash Buffer上，10 000×g離心60 s，棄廢液；再將Spin column放回接液管上，13 000×g離心2 min；將Spin column轉移到一只干凈的1.5 mL離心管，向離心柱內加100 μL Elution Buffer，靜置1 min，13 000×g離心1 min，離心管內液體即為基因組DNA，-20 ℃保存。(2)PCR檢測：在0.2 mL PCR反應管中配制PCR反應體系(引物序列：27F: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R:5’-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物技術有限公司合成)；取PCR擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳25 min；高分辨率質譜分析儀下觀察，若在300 bp處出現熒光條帶，可診斷Hp陽性。

3.2 TUNEL技術檢測凋亡細胞 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%乙醇5 min-75%乙醇5 min-蒸餾水洗。切片組織修復：滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用PBS 1∶9稀釋)，37 ℃溫箱中放置30 min，將玻片置于PBS (pH 7.4)中晃動洗滌3次，每次5 min。滴加破膜工作液，常溫20 min，玻片置于PBS中清洗。按片子數量和組織大小取TUNEL試劑盒內適量試劑覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37 ℃恒溫孵育2 h。清洗TUNEL試劑后，用甲醇配制的3%過氧化氫溶液室溫避光孵育組織15 min，切片稍甩干后，加適量試劑3(converter-POD)覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37 ℃溫箱中孵育30 min。將玻片晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，自來水沖洗切片終止顯色。Harris蘇木素復染3 min左右，自來水洗，1%的鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。切片脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

結果判斷：蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯色出來的陽性凋亡細胞核為棕黃色。采用雙盲觀察計數, 每張切片隨機選取3個陽性染色最明顯的高倍視野(×400),計數300個以上細胞中凋亡陽性細胞所占百分率, 取其平均值，即為凋亡指數(apoptotic index， AI)。

4 統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件對結果進行分析，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，均數比較采用兩獨立樣本的t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PCR技術檢測牙齦組織Hp感染

本次研究采用PCR技術檢測牙齦組織，共送檢30例樣本，其中12例可呈現熒光條帶，即Hp檢測結果呈陽性感染，另外18例則為Hp陰性，陽性率為40%，見圖1。該結果與以往國內外對正常牙周組織Hp陽性率的測試結果無明顯差異，可進行下一步分析。

2 Hp感染組和正常對照組牙齦組織中的細胞凋亡指數

將送檢樣本按Hp感染與否分為2組，經兩獨立樣本均數比較的t檢驗(經方差齊性檢驗, 各組間總體方差齊性相同)，Hp感染組牙齦組織中細胞凋亡指數明顯高于正常對照組(P<0.05)，見表1。凋亡陽性細胞核呈棕褐色, 輪廓清楚, 在Hp感染組牙齦組織中見多量凋亡細胞，而正常對照組牙齦組織中凋亡細胞相對較少，見圖2。

Figure 1.The fluorescent bands of Hp (+) detected by PCR.

圖1 Hp感染PCR熒光帶

表1 Hp感染組和陰性對照組牙齦組織中細胞凋亡指數的比較

Table 1.Comparison of apoptotic index (AI) in Hp positive group and Hp negative group (mean±SD)

GroupnAIHp(+)120.498±0.092Hp(-)180.207±0.053*

*P<0.05vsHp(+) group.

Figure 2.TUNEL staining in gingival tissues (×200).

圖2 牙齦組織細胞凋亡圖

討 論

1 Hp與牙周炎

口腔中的Hp是“過路菌”還是可長期在口腔定植? 它是口腔疾病的致病菌，還是口腔中的正常菌群? 這些相關性問題一直存在爭議。大多數研究認為，Hp可能是一種條件致病菌，當口腔環境發生改變時，Hp可在其中定植，并引起各種相關性疾病。Everhart等[3]對血清Hp抗體的流行病學進行調查，發現血清Hp與牙周病相關參數之間呈正相關，牙周袋內牙菌斑為Hp的生存提供有利的為微需氧環境。在波蘭，Bielahski 等[4]通過大樣本量的調查發現胃Hp感染率與牙周病發病率密切相關。

PCR技術作為一種分子生物學工具，其陽性誤診率低，用于牙菌斑、唾液的檢測，可以選擇性體外擴增，不受標本菌量條件的影響。近年來發展起來的實時熒光定量PCR實現了從定性到定量的飛躍，更在敏感性上得到較大提高，降低漏檢率。熒光定量PCR利用對DNA的高效擴增，在反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號的累積實時反映整個檢測進程，最后根據標準曲線對標記物濃度進行定量分析，除此以外，相比傳統的PCR技術，熒光定量PCR操作簡單、特異性強、污染小。它已廣泛應用于多種微生物感染的檢測，國內外亦有用該方法檢測Hp的報道。Silva等[5]采用PCR方法檢測115例受試者的口腔中的Hp，根據有無胃腸道疾病和牙周疾病分為4 組，證明疾病組的Hp陽性率顯著高于其它組，說明Hp陽性者更易發生牙周炎，并認為在治療Hp相關胃腸道疾病的同時須重視清除牙菌斑。Suzuki等[6]通過PCR技術對326例無消化不良癥狀患者進行Hp檢測，發現Hp感染可能間接與牙周病導致的口臭有關。高靜等[7]用PCR方法檢測37例牙周炎患者口腔菌斑和含漱液中的Hp，結果顯示：尿素酶C基因和CagA基因陽性率在牙周炎組明顯高于健康組，該實驗亦支持Hp參與或加強了慢性牙周炎的致病過程。

然而，也有不少學者認為，Hp只是過路菌，并不在口腔中長期定植，其存在可能是偶居的結果。Namiot等[8]發現胃Hp患者天然牙菌斑的Hp檢出率為89%，但與口腔衛生或牙菌斑的控制均無明顯關聯。Mravak-Stipetif 等[9]也得出了類似的結論。他們通過PCR技術對各種口腔病變組織中的Hp進行了檢測。他們從口腔內7個不同的部位抽取標本，發現161例病人中僅有21例(13.04%)為陽性，并且Hp的存在與否及狀態與診斷結果間也沒有必然的聯系。在以上反對者的研究里，口腔環境中既沒有發現Hp聚集的優勢區，也沒有發現細菌的存在與疾病間的必然聯系。

隨著逐步深入的幽門螺桿菌致病性研究，人們發現每種 Hp所表達和分泌的毒性因子都有其特殊的致病機制。Hp感染口腔后，其毒力因子是否對牙周組織具有致病作用，尚未得到證實。

2 牙周炎與細胞凋亡

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，它并不是病理條件下的自體損傷，而是為更好地適應生存環境而主動死亡，是一種進化保護的過程[10]。研究發現，細胞凋亡是由一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease，caspase)家族參與進行[11-12]。該蛋白酶分別通過外在途徑(死亡受體凋亡途徑)和內在途徑(線粒體凋亡途徑)介導細胞凋亡。細胞凋亡發生時，細胞與周圍細胞群脫離，表面原有的微絨毛、細胞間連接消失，核糖體逐漸從粗面內質網上脫離，內質網囊腔擴脹，其DNA被特征性降解為片段。在電鏡下觀察，細胞凋亡的細胞可發生一系列形態學上的變化，如：染色質濃縮、核碎裂、細胞皺縮等，進而分裂成凋亡小體被免疫細胞吞噬[13]。在口腔領域中，細胞凋亡紊亂被認為是牙周炎、腫瘤、扁平苔蘚等疾病的重要發病機制[14]。

Jarnbring等[15]認為慢性牙周炎牙周袋頂角質細胞較少，容易在炎癥作用下發生細胞凋亡增加。牙周炎致病菌也可導致相關靶細胞凋亡而影響牙周炎的進展過程。馮利等[16]通過流式細胞術檢測，發現細菌毒素誘導免疫細胞活化并促進細胞凋亡是侵襲性牙周炎的發病機制之一。Ekuni等[17]采用TUNEL法給牙周炎大鼠齦溝上皮細胞染色，發現牙齦成纖維細胞發生大量細胞凋亡。Gamonal等[18]在人慢性牙周炎牙齦組織中同樣檢測出降解DNA片段、及caspase-3等的表達。有體外細胞培養和病理組織切片發現，牙周組織損傷過程伴隨細胞凋亡，但具體機制尚不清楚[18-20]。這些結果均表明，牙周組織的細胞凋亡與牙周炎發生發展相關。

3 Hp與細胞凋亡

Hp可分泌多種毒力因子，每種毒力因子的毒性都不相同。有學者通過胃黏膜組織Hp的研究發現，Hp特有的IV型分泌系統將CagA注入宿主細胞，從而激活各種信號酶，產生級聯反應，影響細胞的信息通路傳導，引起病理性細胞應答，最終導致細胞凋亡等變化。幾乎所有的Hp菌株都有VacA基因，其可作為單一致病因子使哺乳動物上皮細胞發生多種明顯的細胞病變效應[21]。Galmiche 等[22]研究發現HPVacA通過作用于線粒體而誘導細胞凋亡。編碼HpVacA的基因在細胞質中表達后，能遷移到線粒體基質。據此推斷，表達VacA基因的HP入侵哺乳動物后，可通過毒素活性調節線粒體膜通透性[23]，從而促進細胞色素C由線粒體釋放到胞漿，并活化相關因子，進一步導致細胞凋亡[24]。

有學者研究Hp感染與整合素β1之間的關系，發現Hp促進細胞凋亡有2種途徑，一種是毒力因子直接作用于宿主細胞誘導細胞凋亡，另一種是引起可抑制細胞凋亡的整合素β1的表達下降。研究證明，整合素β1亞基可與含Arg-Gly-Asp(RGD)序列的Hp的IV型分泌系統蛋白組分特異性結合，通過介導毒性蛋白的轉運調節宿主細胞凋亡、增殖等生物學功能[25]。在以往胃炎的研究中，證實Hp感染產生的炎癥介質、活性氧等可損傷細胞DNA，引發內環境失調，從而誘導細胞凋亡。在胃癌的研究中發現，Hp感染早期因細胞周期調控蛋白異常，發生細胞凋亡水平增加，隨后Hp感染誘導COX-2表達促進PGE2合成，后者誘導細胞增殖并通過刺激Bc1-2表達抑制細胞凋亡，此時凋亡逐漸降低直至無凋亡，增殖活躍加速，最終突變的細胞生長不受限產生癌變。

在近十年的文獻中，有不少學者采用流式細胞術對牙周膜成纖維細胞或牙齦上皮細胞進行Hp相關的體外細胞凋亡研究，共同證實了Hp作為單一因素與牙周組織細胞凋亡的相關性。有研究發現，Hp可以抑制hPDLFs的生長、分裂和增殖。HpCagA和VacA進入細胞后，均可啟動細胞內發生廣泛的rab7依賴的融合及晚期包裹小泡腔隙的滲透性腫脹，誘導細胞空泡化和細胞線粒體的超微結構改變，從而引起哺乳動物上皮細胞凋亡[26-27]。Galmiche 等[22]和Kim等[23]研究發現Hp VacA在細胞質表達后可將N端34 kD亞單位(p34)遷移到線粒體基質，而C端58 kD 亞單位(P58)則保留下來。Willhite等[28]的研究也證明了此觀點。Chiozzi等[29]推斷，Hp可通過毒素活性調節線粒體膜的通透性,從而活化凋亡相關因子半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶3酶原[30]，導致細胞凋亡。馬玲等[31]將Hp VacA與人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)共同培養，發現hPDLFs生長受到抑制，細胞凋亡數量增加。hPDLFs是牙周膜中最多，在功能上也是最主要的細胞。一旦hPDLFs發生結構或性質的改變，都可能會引起牙周病損，進而導致或加重牙周組織疾病的發生。然而，目前并沒有口腔Hp與細胞凋亡的體內研究。

過往研究表明，性別對Hp感染及牙周炎癥意義不大[32]。因此，本實驗并未將該因素納入分組。實驗選取健康牙齦組織進行分析，排除導致牙周疾病的常見紅色致病菌的毒力協作，便于獨立分析Hp感染對牙齦組織細胞凋亡的影響。在TUNEL法顯色結果中，可見Hp感染組棕色凋亡細胞密集分布于上皮全層, 少數散在于固有層內。而正常對照牙齦組織中凋亡細胞相對較少, 兩者AI值差異有統計學意義，推測Hp可導致牙齦組織細胞凋亡。但本次實驗Hp陰性組結果仍高于以往國內對健康牙齦上皮細胞的凋亡細胞指數結果。可能因為樣本對應牙齒均為牙折導致的殘冠，其長期受到不平衡咬合力，而牙周組織是最容易因為受到壓力而產生適應性改建的組織。有文獻證實，長時間的壓力可導致牙齦成纖維細胞凋亡。或許因為如此，本實驗2組細胞的AI值都較高。另外，因本實驗樣本為活檢組織，其壞死細胞和細胞代謝的反應亦呈陽性，使得凋亡細胞計數也會偏高。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Correlation betweenHelicobacterpyloriinfection and apoptosis in gingival tissues

HUANG Shan, LAI Ren-fa, ZHONG Li-zhen

(DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China. E-mail： 13318818388@163.com)

AIM: To observe the effects ofHelicobacterpylori(Hp) on the apoptosis of human gingival tissue. METHODS: Gingival tissue samples were taken from 30 patients without chronic periodontitis, and Hp was detected by conventional PCR. The apoptosis of the gingivival cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) to analyze the correlation between Hp infection and apoptosis of the gingival tissues. RESULTS: The Hp positive detections were 12 in the 30 patients without periodontitis, so the positive rate of Hp in the gingival tissue samples was 40%. The gingival tissue showed a large number of apoptotic cells in Hp positive group, and less apoptotic cells in Hp negative group. The apoptotic index in Hp positive group (0.498±0.092) was significantly higher than that in normal group (0.207±0.053) (P<0.05). CONCLUSION: Hp might play a role in the apoptosis of gingival tissues.

Gingival tissue;Helicobacterpylori; Apoptosis

1000- 4718(2017)07- 1323- 06

2017- 02- 27

2017- 04- 20

R781.4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.028

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 13318818388; E-mail: 13318818388@163.com