豬流行性腹瀉病毒變異毒株一步法SYBR Green I熒光RT-PCR檢測方法的建立及應用

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

豬流行性腹瀉病毒變異毒株一步法SYBR Green I熒光RT-PCR檢測方法的建立及應用

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

為了建立豬流行性腹瀉病毒變異毒株快速、敏感的檢測方法。本研究利用RT-PCR技術擴增出豬流行性腹瀉病毒變異毒株S基因中298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T載體中作為標準品制作標準曲線，建立了PEDV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達5.2×101拷貝，與豬流行性腹瀉病毒經典毒株、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒2型、豬藍耳病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒均不發生交叉反應，具有良好的特異性和重復性。結果表明，建立的實時熒光定量RT-PCR具有特異、敏感、快速、定量、重復性好等優點，可用于臨床PEDV變異毒株的檢測。

豬流行性腹瀉病毒變異毒株；SYBR Green I；熒光定量RT-PCR

豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Di-arrhea Virus，PEDV)引起的一種豬腸道傳染性病毒病，以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征[1]。該病首次報道于英國[2]，隨后，世界各國均有相關報道[3,4]。該病主要發生在冬季，夏季也可發生。各年齡的豬均可感染發病，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的感染發病率可達100%，哺乳仔豬病死率可達50%以上，常與豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus， TGEV)、輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)等其他腸道病毒混合感染，給養豬業帶來了很大的經濟損失[5]。PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)成員，PEDV基因組全長約28kb，為單股正鏈RNA病毒。其中其主要結構蛋白纖突蛋白(S)對被感染宿主中和抗體的產生、特異性受體的結合以及細胞膜融合等方面具有重要的生物學意義[6]，S蛋白的變異將會導致其宿主范圍、組織細胞培養及毒力發生改變[7]。我國現階段廣泛流行的PEDV與以往的毒株相比，已經發生了較為明顯的變異，變異毒株已成為優勢毒株，這可能也是導致免疫失敗的一個重要原因[8～10]。PEDV抗原傳統的檢測方法如病毒分離鑒定、熒光抗體檢測、ELISA等，不僅操作繁瑣，費時費力，難以檢測出微量病毒，而且無法區分PEDV變異毒株與疫苗株或經典毒株。因此，有必要建立一種簡便的PEDV變異毒株的檢測方法。本試驗據PEDV變異毒株S基因保守序列設計1對引物，建立PEDV變異毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，為快速檢測PEDV變異毒株提供了一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)經典毒株、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬藍耳病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒(RV)由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2016年1～10月采自山東省各地豬場臨床診斷為PEDV感染的豬的腸道、糞便等。

1.2 試劑和試劑盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T載體、DL2000 Marker、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)等購自寶生物工程(大連)有限公司，多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司產品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.3 RT-PCR引物設計與合成

參照GenBank中登錄的PEDV變異毒S基因(JQ257005)序列，應用Primer Premier 5.0軟件，設計1對引物，擴增PEDV S基因部分片段298bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P1：5'-CGAAAACCAGGGTGTCAA-3'，P2：5'-CGGGATGGCTTTGTTAAATA-3'。1.4 PEDV S基因的 RT-PCR

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取PEDV的RNA，作為模板，按照反轉錄說明書進行cDNA的合成，PCR擴增體系如下：反應總體系為25μL，其中Premix Taq 12μL，cDNA 2μL，上、下游引物各0.5μL(50μmol/L)，加去離子水至25μL。反應程序為：95℃ 5min；94℃ 20s、52℃ 20s、72℃ 20s，35個循環；72℃ 10min。擴增后用質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 制備重組質粒標準品

將PCR產物純化回收后，連接到MD18-T載體，構建重組質粒pMD-S，重組質粒由寶生物工程(大連)有限公司測序驗證。將重組質粒pMD-S利用紫外分光光度計測定其在260nm和280nm處的吸光度，計算出質粒中的DNA濃度和純度，并進行10倍倍比梯度稀釋，作為陽性定量標準模板，用于熒光定量RT-PCR的擴增和標準曲線的建立。

1.6 一步法熒光定量RT-PCR

按照One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)說明配置反應體系，體系總體積為20μL：2×One Step RT-PCR Buffer 10μL，RNase freed H2O 5.6μL，P1(10pmol/μL)和P2(10 pmol/μL)各0.4μL，Ex Taq HS(5U/ μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，模板RNA 2μL。離心數秒后，放入Light Cyeler 480實時熒光定量PCR儀中，按以下程序進行反應：42℃反轉錄5min，95℃預變性10s，95℃變性5s，52℃退火10s，72℃延伸10s(此處收集熒光)，升降溫速度均設置為20℃/s，擴增40個循環。擴增結果Ct值小于37的為陽性，Ct值在37～40之間的被認為可疑，重復試驗如果仍然在37～40之間則視為陰性，無Ct值的為陰性。

1.7 熒光定量PCR的擴增及標準曲線的制備

以10倍梯度稀釋的已知拷貝數的重組質粒為模板進行熒光定量RTPCR擴增，按1.6方法進行實時定量RT-PCR試驗，并利用隨機軟件進行分析，得到動力學曲線及標準曲線。

1.8 熒光定量 PCR特異性、敏感性、重復性試驗

用建立的熒光定量RT-PCR方法對PEDV變異毒株、PEDV經典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV進行特異性檢測。將模板質粒做10倍梯度稀釋，用熒光定量RT-PCR進行擴增，以此測定熒光定量RT-PCR所能檢出的最低模板的拷貝數，并與普通PCR比較。選取同一批次的3個不同濃度和不同批次3個不同濃度的質粒標準品作為模板，為評價標準品的穩定性，在同一批次試驗中進行測定和在不同批次試驗中進行測定，同時設NTC。

1.9 臨床樣品檢測

用建立的熒光定量RT-PCR法對從山東省各地收集的臨床疑似病料86份進行PEDV變異毒檢測，同時用常規RT-PCR法進行檢測，并比較二者檢測結果。

2 結果

2.1 目的基因PCR擴增及克隆

利用RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳初步檢測表明，擴增產物約為298bp，與預期結果相符(圖1)。將擴增的目的片段純化后，克隆于pMD18-T載體中，構建重組質粒pMD-S，將其測序結果與GenBank中PEDV變異毒S基因的相應片段進行比較，結果證實該擴增產物與PEDV變異毒S基因的相應區域的同源性為100%。

2.2 熒光定量PCR標準曲線的建立

以預試驗篩選的5個稀釋度的重組質粒作模板，進行熒光定量RTPCR擴增，生成動力學曲線和標準曲線，如圖2所示，曲線1-5所對應的重組質粒模板濃度分別為5.2×108、5.2×107拷貝、5.2×106拷貝、5.2×105拷貝、5.2×104拷貝，曲線6是陰性對照(即NTC)，未發生擴增，線性回歸方程為Ct＝－3.352×lgcopies＋44.80(R2＝0.9997)。

在SYBR Green I熒光定量RTPCR完成后進行熔解曲線分析，擴增產物的溶解溫度Tm為85.5～86.0℃，無非特異性產物和引物二聚體的峰值出現，標準品均一穩定。

2.3 特異性檢驗

按建立方法對PEDV變異毒株、PEDV經典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV的陽性樣品進行熒光定量RT-PCR檢測，只有PEDV變異毒株的樣品孔出現了單一的s型擴增曲線(圖3)，表明所建立的針對PEDV的熒光定量RT-PCR方法具有較強的特異性。

2.4 敏感性試驗

將制備的質粒模板10倍倍比稀釋，并分別以此為模板進行熒光定量RT-PCR擴增，得到不同濃度的質粒標準模板的real-time PCR擴增曲線，曲線1-6所對應的重組質粒模板濃度分別為5.2×105、5.2×104、5.2×103、5.2×102、5.2×101、5.2×100拷貝，結果顯示，其靈敏度為5.2×101拷貝，與常規RT-PCR結果對比，熒光定量RT-PCR的靈敏度比常規RT-PCR高100倍(圖4)。

2.5 重復性檢驗

為了驗證熒光RT-PCR檢測結果的重復性，選取3個標準品進行批內和批間重復性測定，結果樣品的Ct值及Tm值批內重復性試驗CV值均小于2.0%，批間重復性試驗CV值均小于1.0%，表明本方法的重復性好(表1)。D組陰性對照組，未檢測到熒光信號。

2.6 臨床樣品檢測

分別用建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR和普通RT-PCR方法，對臨床收集的86份疑似PEDV樣品進行檢測，檢測結果為：SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測到39份陽性，而普通RT-PCR檢測到35份陽性。

圖1 PEDV VP60基因RT-PCR擴增結果

圖2 熒光定量PCR動力學曲線和標準曲線

圖3 PEDV變異毒株 S基因特異性檢驗動力學曲線

圖4 PEDV變異毒株熒光定量RT-PCR(A)與常規RT-PCR(B)檢測敏感性比較

表1 SYBR GreenⅠ實時熒光PCR的組內和組間重復性試驗結果

3 討論

PED從2010年底開始在我國大范圍暴發流行，臨床上主要表現高發病率和高死亡率的哺乳仔豬腹瀉(病死率達80%～100%)，目前，臨床上呈現變異毒株和經典毒株混合感染，但以變異毒感染為主[8]，而國、內外商品化疫苗毒株如我國的CV777株，和韓國的KPED-9和DR13株均為經典毒株，因此，疫苗的免疫效果不理想。與傳統的檢測方法相比，熒光定量RT-PCR檢測方法具有明顯的優勢。國內專家、學者曾采用染料法[11]和探針法[12]的熒光定量RT-PCR檢測PEDV，但都屬于兩步法，即反轉錄和PCR反應時分開進行，操作繁瑣，本研究采用一步法熒光定量RT-PCR方法檢測PEDV變異毒，不需要單獨做反轉錄，反轉錄與PCR擴增在同一個反應管中進行一步完成，操作簡單，避免了由于多次操作而造成的污染問題，反轉錄時間只要5min，比傳統的方法節省了1個多小時，能快速得到檢測結果，可檢測微量病毒，對質粒標準品最低檢測限為5.2×101拷貝。得到的熔解曲線只出現特異的單個峰，產物的Tm值均一，表明沒有引物二聚體及非特異性擴增產物出現，特異性好，對PEDV有陽性擴增信號，對PEDV經典毒株、CSFV、PRV、PCV2、PRRSV、TGEV、RV均無特異性反應，對臨床86份病料進行檢測結果顯示，該法可檢測出39份陽性，而普通RT-PCR僅檢測出35份陽性，表明該SYBR Green I熒光定量方法對于PEDV的檢測比普通RT-PCR方法靈敏度高，能檢出普通RT-PCR不能檢出的病料。

本研究建立的PEDV變異毒株一步法熒光定量RT-PCR檢測方法簡便、快速、特異、敏感，能夠對當前流行的PEDV變異毒株進行定性和定量檢測，對PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴發PEDV野毒感染的研究更有臨床意義，為進一步開展PEDV變異毒感染的分子流行病學調查和診斷，為研發變異毒PEDV的新型分子診斷試劑盒奠定了基礎。■

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山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17)。