水溫對草魚血清活性氧含量及抗氧化防御系統的影響

羅 偉，許 艷，劉曉娟，王春芳

(華中農業大學水產學院，池塘健康養殖湖北省工程實驗室，淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，武漢 430070)

水溫對草魚血清活性氧含量及抗氧化防御系統的影響

羅 偉，許 艷，劉曉娟，王春芳

(華中農業大學水產學院，池塘健康養殖湖北省工程實驗室，淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，武漢 430070)

研究不同水溫(22、26、30和33 ℃)對草魚(Ctenopharynodonidellus)血清活性以及抗氧化系統的影響。實驗選取180尾均重為55.4 g的草魚，隨機分為4組，每組設3個重復，每重復15尾魚。在室內微循環系統中，采用加熱棒(EHEIM 3619 aquarium Heater)進行控溫，投喂含粗蛋白33.78%的配合飼料。8周養殖試驗結束后，計算草魚生長指標，測定草魚血清ROS、SOD、CAT、T-AOC含量和GSH-Px活性。結果顯示:溫度顯著影響到草魚生長，當水溫為30 ℃，草魚生長最快；血清中ROS、SOD隨著溫度的升高顯著升高；T-AOC、GSH-Px隨著溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，水溫為30 ℃達到最高；CAT隨著養殖水溫的變化，各組之間無顯著性差異。結果表明，30 ℃為草魚生長最適溫度，水溫22～30 ℃，草魚體內的抗氧化酶系統能夠維持體內自由基的“自穩態”，當水溫過高(33 ℃)時，則會造成草魚高溫損傷，從而影響草魚代謝和生長。

水溫；活性氧；抗氧化；草魚(Ctenopharynodonidellus)

草魚(Ctenopharynodonidellus)是我國四大家魚之一，是我國產量最高的淡水魚養殖品種。研究發現，在養殖池塘中，草魚在夏季會遭受到高溫脅迫，進而影響到草魚的存活、生長和免疫應答，嚴重影響到草魚養殖的經濟效益[1-2]。

魚類是變溫動物，水溫不僅影響魚類的生長和代謝，也影響魚類的抗氧化防御體系[3]，由于水溫隨著季節和晝夜會不斷發生變化，魚類細胞內線粒體的數量和功能為了適應這種變化也會隨之發生變化[4]，這種變化直接影響著魚體內活性氧(ROS)和魚類抗氧化防御體系[5]。而大量產生的ROS會造成機體蛋白質、脂質和DNA等大分子物質的損傷[6]，正常機體內，ROS能夠由機體抗氧化系統所降解，從而維持機體穩態。機體的抗氧化系統包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，而總抗氧化能力(T-AOC)是反映機體抗氧化總體性能的一個指標[7]。

已有研究表明，水溫對于草魚的生長、消化率、能量收支具有顯著影響[8-9]。高溫對草魚hsp70和hsp90熱休克蛋白的表達有顯著影響[10]，但是關于草魚的氧化應激的研究較少，關于水溫和草魚氧化應激之間的關系未見報道。草魚生長最適溫度為30 ℃，過高水溫會導致草魚熱休克蛋白表達所需能量由無氧代謝提供[11-12]，從而影響草魚生存和生長。為研究不用水溫對草魚血清活性氧和抗氧化系統的影響，本研究測定了在不同水溫養殖條件下草魚血清ROS含量、SOD活性、CAT活性、T-AOC和GSH-Px活性的變化，進一步探討在不同溫度養殖條件下草魚機體抗氧化體系變化規律，比較不同水溫對草魚抗氧化防御系統的影響，從而進一步為草魚精準化養殖提供一定的定量指標和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用草魚購買于湖北省黃岡市紅安縣高橋漁場，選取較為活躍的草魚在華中農業大學地下室循環水養殖系統中暫養，養殖缸的體積為300 L，并在實驗條件下馴化一周以適應實驗室養殖環境。

實驗飼料按配方混合后經顆粒飼料機制成直徑為0.35 mm，長度為1～2 mm的顆粒，并于4 ℃冰箱保存。實驗飼料粗蛋白含量為33.78%，飼料配方及化學組成見表1。

1.2 試驗魚養殖

表1 實驗飼料配方及化學成分Tab.1 Formulation and chemical composition of the experiment diet

注：維生素預混物：維生素A110萬IU，維生素D324萬IU，維生素E 8 g，維生素K30.3 g，維生素B10.6 g，維生素B20.7 g，維生素B60.7 g，維生素B124 mg，維生素C 15 g，煙酸4 g，泛酸鈣4 g，葉酸200 mg。2.礦物質預混物：鐵15 g，銅400 mg，鋅6 g，錳2 g，碘60 mg，硒20 mg。

1.3 取樣測定

養殖試驗前后，稱量各組魚體重量計數，計算草魚增重率和特定增長率。養殖試驗結束后，試驗魚饑餓 24 h 取血清樣。每缸隨機取5 尾魚尾靜脈采血，混合血樣3 000 r /min 離心 15 min，取血清-20 ℃保存備用。活性氧(ROS)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總抗氧化能力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒的測定方法測定，每個指標重復測定 3 次。

1.4 計算公式

草魚生長指標計算公式：

(1)存活率= (N2/N1) × 100%

(1)增重率(WG)=100%×(Wt-W0)/W0

(2)特定增長率(SGRw) = 100 %×(lnWt-lnW0)/t

上述公式中N1代表實驗前草魚數量，N2代表試驗結束后草魚存活數，Wt(g)和W0(g)分別是魚體終末和初始濕重，t為養殖時間。

1.5 數據處理

數據整理使用Microsoft Excel 2003進行，使用SPSS軟件進行數據的單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進行Duncan’s 多重比較，以P<0.05作為顯著性差異水平。

2 結果和分析

2.1 不同水溫下草魚生長指標

表2顯示了4種溫度對草魚的存活率沒有顯著影響(P>0.05)，隨著溫度的上升草魚的的增重率(WG)、特定增長率(SGR)呈現先上升后下降的趨勢，各組之間存在顯著性差異(P<0.05)，水溫為30 ℃時，草魚生長性能最佳。

表2 不同溫度下草魚幼魚生長的影響Tab.2 Effect of water temperature on the growth performance of grass carp

注：數據是來自3個平行缸的平均值±標準誤，同列數據后上標字母不同(P<0.05)，下同

2.2 不同溫度對草魚血清活性氧(ROS)和抗氧化指標的影響

從表3可以看出，隨著水溫的上升，草魚血清中活性氧含量隨著水溫的升高而升高，33 ℃水溫中草魚血清ROS含量最高，22 ℃的ROS含量最低，并且4個溫度組之間均具有顯著性差異(P<0.05)，22-26 ℃水溫間，SOD酶活力無顯著性差異(P>0.05)，26 ℃以上，血清中SOD酶活力隨著溫度的升高而升高，在33 ℃水溫中達到最大值，且兩組之

間SOD酶活力存在顯著性差異(P<0.05)。

隨著水溫的升高，血清中CAT酶活呈上升的趨勢，并在水溫為33 ℃時達到最大值，但各水溫組間無顯著差異(P>0.05)，說明水溫對CAT活性影響不大。

血清T-AOC酶活隨著水溫的上升呈先上升后下降的趨勢，在水溫為30 ℃時達到最高值，30 ℃水溫和22 ℃水溫之間存在顯著性差異(P<0.05)，其余各組無顯著性差異(P>0.05)。

表3 不同溫度對草魚血清活性氧(ROS)和抗氧化指標的影響Tab.3 Effects of temperature on ROS and hermal biochemical of grass carp.

草魚血清GSH-Px活性隨著水溫的升高呈上升的趨勢，并在33 ℃達到最大值， 33 ℃和30 ℃水溫組較22 ℃水溫組存在顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

水溫作為池塘養殖中重要的環境因子，不僅會影響池塘中的理化因子，亦會直接影響到魚類的代謝速率，從而進一步影響到魚類的攝食和生長[13-15]。本研究表明，草魚的最適生長溫度為30 ℃，和崔奕波[16]研究結果一致，當水溫超過30 ℃時，草魚的生長會顯著下降。實驗中的高溫環境(33 ℃)會對草魚造成一定程度的熱應激反應，產生高溫脅迫。研究表明，水溫升高會導致魚體耗氧量增加，從而很可能促進機體內ROS的產生和機體細胞組分的氧化狀態，引起機體抗氧化酶體系的相應變化[17-18]。從本次實驗結果來看，ROS含量隨著水溫的升高而升高，說明高溫促進了草魚血清內ROS的產生，這和不同水溫對中華鱘血清活性氧影響的研究結果類似[19]。

研究表明，機體內ROS的增加，如不及時清除，極可能會對機體造成氧化損傷或氧化應激，機體可通過提高體內抗氧化酶活力和其他防御形式，對氧化損傷進行修復[20]。本次研究表明，在不同的水溫下，草魚血清內各種抗氧化酶活性和氧化劑隨著水溫呈現出不同的變化。

SOD使得機體內超氧陰離子(O2-)轉化為過氧化氫(H2O2)，是細胞抗氧化系統的一道重要防線，同時SOD酶能夠間接反映機體消除自由基的能力[21]。本次試驗中，33 ℃的水溫并沒有使草魚血清中SOD酶活下降，SOD酶活隨著水溫的升高而升高，結果和尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[22-23]的研究結果相同，說明SOD酶在高溫環境下，能夠抵抗由于高溫脅迫帶來的氧化損傷。

Abele等[24]認為在一定溫度范圍內,水生生物的CAT活性對溫度變化的響應存在不顯著的現象。本實驗中，草魚血清中CAT酶活隨著溫度的升高呈現上升的趨勢，但是各組之間無顯著性差異，這與李大鵬等[19]在中華鱘(Acipensersinensis)中的研究結果一致。但有研究報道，水溫對華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)血清CAT活性有顯著性影響[25-26]，可見，水溫對養殖對象血清CAT活性隨品種不同而異。

T-AOC是反映機體總抗氧化能力的一個指標。草魚血清總抗氧化能力(T-AOC)隨著水溫的升高而升高，到30 ℃達到最大值，隨后出現下降，試驗結果和對大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)的研究結果類似[27]。33 ℃的高溫脅迫使得草魚血清T-AOC顯著下降，說明在一定溫度范圍內，隨著水溫的升高，草魚血清T-AOC隨之升高，一旦發生高溫脅迫時，草魚血清T-AOC會隨著溫度的上升而下降。草魚血清T-AOC在高溫脅迫時出現下降，原因可能與機體內抗氧化酶的活性和氧化劑含量的聯合作用有關。高溫環境下(33 ℃)，草魚血清中ROS顯著升高，而T-AOC反而略有下降，提示當環境溫度超過一定的范圍之后，草魚會受到不同程度的氧化損傷。GSH-Px是生物體在長期進化過程中形成的抗氧化系統中的酶類抗氧化劑，在體內廣泛存在，可防止因自由基產生的脂質過氧化物堆積所造成的生物膜損害，降解過氧化氫，保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[28]。本研究結果顯示：草魚血清中GSH-Px活性是所測定的抗氧化酶種類中活力最強的一種。草魚血清中GSH-Px活性隨著溫度的升高而升高，且33 ℃時，該酶仍能保持較高活力，表明該酶在清除和抵御體內ROS增加造成的氧化應激反應中起著重要的作用。由于GSH可以和ROS反應起到防御氧化應激的作用，同時GSH-Px能夠催化GSH變為GSSG[29]，使得有毒的過氧化物還原轉變成無毒的羥基化合物。因此，草魚血清中ROS隨著溫度升高而增加，為抵御ROS增加，GSH消耗也隨之增加，進而導致能夠催化GSH所需要的酶GSH-Px增加，從而抵御高溫環境所帶來的脅迫。

綜上所述，草魚在適當的水溫中，可依靠自身的抗氧化防御系統，抵御活性氧增加帶來的機體損傷，當溫度超過一定范圍后，草魚機體內抗氧化酶系統雖然會起到一定的抗氧化防御作用，但是ROS的快速產生，消除ROS速度不能減緩，將會導致高溫環境下LP的程度顯著高于低溫環境，而低溫環境ROS隨著水溫的增加而增加，但抗氧化酶和抗氧劑始終能夠維持著自由基的穩態，從而進一步解釋了高溫會影響草魚的攝食和生長。

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Effect of water temperature on serum content of reactive oxygen species and antioxidant defense system in grass carpCtenopharyngodonidellusin

LUO Wei，XU Yan，LIU Xiao-juan，WANG Chun-fang

(HubeiProvincialEngineeringLaboratoryforPondAquaculture/FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince/CollegeofFisheries，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

The present study investigated effects of different temperature (22℃,26℃,30℃ and 33℃) on growth and serum antioxidant system of grass carp.Grass carp whose average weight was 55.4 g were randomly divided into four groups,with 3 replications and 15 fish each tank.The diet contained 33.78% crude protein.Fish were raised in indoor micro-circulation system and heating rods (EHEIM 3619 aquarium Heater) were used for temperature control.After 8 weeks of feeding trial,growth indexes,activities of SOD,CAT and GSH-Px,contents of ROS and T-AOC were determined.The results showed that temperature significantly affected the growth of grass carp and growth rate peaked at 30℃.ROS and SOD in serum significantly increased by temperature.T-AOC and GSH-Px increased firstly and then decreased and peaked at 30℃.There was no significant difference among groups in terms of CAT as temperature changed.Therefore,it can be concluded that 30℃ is the best temperature for the growth of grass carp.When the water temperature is in the lower range,antioxidant enzymes and antioxidants could maintain the homeostasis of free radicals.If the water temperature is too high,it will cause damage to grass carp and thereby affects metabolism and growth of grass carp.

water temperature；reactive oxygen species；antioxidant defense system；Ctenopharyngodonidellus

2016-03-08；

2017-03-28

現代農業產業技術體系專項基金CARS-46；中央高校基本科研業務費專項資金(2013PY076)

羅 偉(1990- )，碩士研究生，專業方向為魚類營養與環境。

王春芳。E-mail:cfwang@mail.hzau.edu.cn

S931.3

A

1000-6907-(2017)04-0003-05