豬SLA-DRA基因SNP位點篩選及其生物信息學分析

劉麗霞，張 麗，田曉靜，陳 紅，寸海霞，金 麗，譚小音，謝德瓊

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

豬SLA-DRA基因SNP位點篩選及其生物信息學分析

劉麗霞，張 麗，田曉靜，陳 紅，寸海霞，金 麗，譚小音，謝德瓊

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

以八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬為研究對象，利用PCR-SSCP和測序方法對SLA-DRA基因4個外顯子進行SNP位點篩選，并利用生物信息學軟件預測各SNP位點對DRA基因mRNA二級結構、蛋白質二級結構和三級結構的影響。結果在3個豬種中共檢測到6個DRA基因SNP位點，分別為外顯子1的A177G，外顯子2的A3093C，以及外顯子4的A4167G、A4246G、C4282T和G4293A，其中A3093C、A4167G和G4293A為錯義突變，分別導致甲硫氨酸(Met)變為亮氨酸(Leu)、谷氨酰胺(Gln)變為精氨酸(Arg)和精氨酸(Arg)變為組氨酸(His)。以3個錯義SNP位點為基礎，構建了6種DRA單倍型，其中H1、H3和H6為主要單倍型，頻率分別為0.25、0.21和0.21。生物信息學分析表明，三個豬種DRA基因單倍型的mRNA二級結構、蛋白質二級結構和三級結構與野生型均存在一定的差異。研究結果可為八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬的保種和抗病育種提供理論依據。

豬;SLA-DRA;SNP位點;生物信息學

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)是一組高度多態且緊密連鎖的基因群，參與免疫反應中的抗原呈遞，與機體抗病性和免疫應答密切相關[1]。豬主要組織相容性復合體又被稱為豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)，位于豬7號染色體著絲粒的兩端，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類分子構成[2-3]。具有功能的經典SLAⅠ類基因編碼蛋白質的主要功能是將抗原遞呈給 CD8+細胞毒性T細胞，還可以與自然殺傷細胞(NK)相互作用以阻止 NK 細胞介導的細胞毒性；SLAⅡ類抗原的主要作用是呈遞外源抗原給CD4+輔助T細胞；SLAⅢ類基因的主要作用是控制某些補體成分及其受體產生，而其產物不參與抗原呈遞[4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點是指在基因組水平上由單個核苷酸變異而引起的DNA序列的改變，位于基因編碼區的SNP位點會影響翻譯后氨基酸的類型，進而影響蛋白質的結構和功能。SLA-DRA基因位于SLAⅡ類分子α鏈上，能在蛋白質水平進行表達，其編碼產物與抗原肽結合能產生有效的免疫應答。早期研究表明，SLA-DRA基因不存在SNP位點[5-6]。而Nielsen和Thomsen[7]發現SLA-DRA基因具有多態性。孫俊麗等[8]發現五指山豬DRA基因外顯子2上有1個SNP位點。Yang 等[9]對杜洛克豬、大白豬和長白豬的DRA基因進行檢測，在外顯子1、2和4上分別檢測到2、2和6個SNP位點。Yang等[10]和Huang等[11]發現煙臺黑豬DRA基因外顯子1、2和4上分別有2、2和7個SNP位點[10-11]。Dillender等[12]發現大多數的淋巴細胞可以表達SLA-DR基因。八眉豬DRA外顯子2上僅有1個SNP位點[13]，另外，DRA基因與仔豬腹瀉具有一定的相關性[9-11]，八眉豬DRA蛋白的免疫應答概率較高[14]。

八眉豬又被稱為注川豬或西豬，是我國著名的地方豬種，具有適應性強和抗逆性好等特點，且遺傳性能穩定，是優質的地方良種豬[15]。甘南蕨麻豬又稱合作豬或山豬，是甘肅省的原始地方特色品種，具有生命力和抗逆能力強等特點，且有近交不退化等特征[16]。甘肅黑豬是甘肅省經過雜交試驗、橫交擴群和閉鎖繁育培育得到的豬新品種，含有八眉豬、巴克夏和內江豬的血緣，具有繁殖力強和抗逆性強等特征[17]。

本研究利用PCR-SSCP和測序技術對八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬SLA-DRA基因4個外顯子序列進行了SNPs檢測，并預測了SLA-DRA基因mRNA二級結構，對比分析了SNP位點突變前后DRA蛋白二級結構和三級結構，為研究DRA基因對疾病的影響奠定理論基礎，也為八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬的保種和抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

八眉豬(222頭)來源于青海省八眉豬保種廠，蕨麻豬(147頭)來源于甘肅省臨夏縣盛源牧業有限責任公司，甘肅黑豬(102頭)來源于蘭州軍區寺兒坪養殖基地。選取哺乳期仔豬為采樣對象，于仔豬出生后1周內剪取耳組織約3～5 g，置于裝有75%乙醇的離心管中，-20 ℃冰箱保存備用。采用傳統的酚-氯仿抽提法進行豬耳組織基因組DNA提取，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 PCR引物設計和擴增

根據GenBank數據庫中太湖豬DRA基因序列(登錄號AY303990)，使用Primer 5.0 軟件設計DRA基因4對引物(表1)，分別擴增DRA基因4個外顯子，引物由大連寶生物科技股份有限公司合成。

PCR擴增反應總體積25 μL，其中10×PCR buffer(25 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL，dNTP (各2.5 mmol·L-1)1 μL，TaqDNA 聚合酶 (5 U·μL-1)0.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，基因組DNA(50～100 ng·μL-1)1 μL，滅菌超純水18.5 μL。擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

擴增條件：94 ℃ 2min; 94 ℃ 20s,退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。

1.3 PCR-SSCP分析

取2 μL PCR產物和8 μL的DNA變性緩沖液，混勻后98 ℃變性10 min，冰浴10 min后上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。DRA基因各外顯子電泳條件見表2。

表1DRA基因引物序列

Table 1 DNA primers information ofDRAgene

外顯子Exons引物序列Sequence(5′→3′)退火溫度Annealingtemperature/℃片段長度LengthofPCRproduction/bp外顯子1Exon1(151-226)F：CTTTGCTTGTATTGCR：ACCTAACTACCCCTC568186外顯子2Exon2(2884-3129)F：CAGAGAATCACGTGATCATR：ACAGGTACCATTGGTGTT550257外顯子3Exon3(3573-3854)F：TGCTAAACAGGGAAGGCTR：ACAAAGGAGACTGAGGGATG568352外顯子4Exon4(4155-4309)F：TCCCGTAATACATCGTTCR：TTCCTTTCCTTGGCTCAT556357

1.4 序列測定和分析

對SSCP結果進行判型，選取各外顯子不同基因型個體進行PCR產物直接測序。利用MEGA6.0軟件對測序結果進行校正和序列拼接，并將測序結果與AY303990序列進行比對，從而確定SNP位點。利用BioEdit對序列峰圖進行編輯。

1.5 SNP位點基因頻率計算

利用Popgene 32軟件計算等位基因頻率，依據DRA基因4個外顯子等位基因頻率和SNP位點在等位基因中的分布計算SNP位點基因頻率。

1.6 單倍型構建

利用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)構建DRA基因SNP位點的單倍型，并分析SNP位點間的連鎖不平衡。

1.7 生物信息學分析

利用RNA fold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預測DRA基因mRNA二級結構；利用PredictProtein在線服務器預測DRA蛋白二級結構(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)；利用SWISS-MODEL同源建模方法構建DRA蛋白三級結構模型(http://swissmodel.expasy.org/)，運用PyMOL軟件對突變前后DRA蛋白三級結構進行對比并繪制結果視圖。

表2DRA基因4個外顯子PCR擴增產物SSCP電泳條件

Table 2 The optimized electrophoresis conditions for PCR amplicons of four exons ofDRAgene

PCR產物PCRproduct凝膠濃度ConcentrationofPAGE/%冷循環溫度Circulatingwatercoolanttemperature/℃電壓Voltage/V電泳時間Time/h電壓Voltage/V電泳時間Time/h外顯子1Exon112(39∶1)42500520020外顯子2Exon210(29∶1)42500520020外顯子3Exon310(39∶1)42500520020外顯子4Exon410(29∶1)182500520016

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

3個豬種耳組織基因組DNA提取結果經0.8%瓊脂糖電泳檢測見過如圖1所示，依據圖片結果，選取條帶清晰明亮、無拖帶的DNA進行擴增。

2.2 PCR擴增結果

PCR擴增產物電泳片段大小與預期片段大小相符，且條帶清晰、特異性良好(圖2)。

圖1 豬基因組DNA提取結果Fig.1 Extraction results of genomic DNA of pigs

M1、M3、M4， 100 bp DNA marker；M2， DL2000 DNA marker； A， 外顯子1 PCR產物； B， 外顯子2 PCR產物； C， 外顯子3 PCR產物； D， 外顯子4 PCR產物M1， M3 and M4， 100 bp DNA marker; M2， DL2000 DNA marker; A， PCR product of exon1; B， PCR product of exon2; C， PCR product of exon3; D， PCR product of exon4圖2 DRA基因4個外顯子PCR擴增結果Fig.2 Agarose gel results of PCR amplification result of four exons in DRA gene

2.3 PCR-SSCP檢測結果

DRA基因4個外顯子PCR-SSCP檢測結果和判型如圖3所示，3個豬種DRA基因4個外顯子分別檢測到3、3、1和6種基因型和2、2、1和5種等位基因，DRA基因外顯子1、2和4均具有多態性而外顯子3無多態性。3個豬種DRA基因4個外顯子各基因型頻率如圖4所示，在外顯子1上，3個豬種的BB型為優勢基因型；在外顯子4上，3個豬種的GH型為優勢基因型；而在外顯子2上，八眉豬的優勢基因型為CC，而蕨麻豬和甘肅黑豬的優勢基因型為CD。

2.4 序列測定結果

序列測定結果表明，3個豬種DRA基因4個外顯子上共有6個SNP位點，A177G位于外顯子1上，A3093C位于外顯子2上，A4167G、A4246G、C4282T和G4293A位于外顯子4上(圖5)。其中A3093C、A4167G和G4293A為錯義突變，分別導致甲硫氨酸(Met)變為亮氨酸(Leu)、谷氨酰胺(Gln)變為精氨酸(Arg)以及精氨酸(Arg)變為組氨酸(His)。

2.5DRA基因SNP位點基因頻率

DRA基因SNP位點基因頻率計算結果見表3，三個豬種各SNP位點基因頻率差異較大，蕨麻豬在6個位點上均檢測到多態性，而八眉豬在G4293A位點上未檢測到多態性，甘肅黑豬在A4246G位點上未檢測到多態性。

圖3 三個豬種DRA基因4個外顯子PCR-SSCP檢測結果Fig.3 PCR-SSCP banding patterns for four exons of DRA in three pig breeds

圖4 三個豬種DRA基因4個外顯子基因型頻率Fig.4 Genotype frequency of four exons of DRA gene in three pig breeds

圖5 DRA基因擴增產物測序峰圖及SNP位點Fig.5 Sequencing peak of PCR products and SNP sites of DRA gene

2.6 單倍型構建和連鎖不平衡分析

利用DRA基因3個錯義突變位點(A3093C、A4167G和G4293A)構建單倍型，結果表明,3個SNP位點共有6種單倍型組合(表4)，分別為：H1(A-A-G)、H2(A-A-A)、H3(A-G-G)、H4(C-A-G)、H5(C-A-A)和H6(C-G-G)，其中H1、H3和H6為主要單倍型，頻率分別為0.25、0.21和0.21，H2頻率最低，僅為0.05。將GenBank中太湖豬DRA基因(登錄號AY303990)定義為野生型單倍型，對比發現，H1與野生型序列完全相同，H2的突變位點為G4293A，H3的突變位點為A4167G，H4的突變位點為A3093C，H5的突變位點為A3093C和G4293A，H6的突變位點為A3093C和A4167G。對3個SNP位點兩兩之間進行連鎖不平衡參數進行計算，估計各位點之間的連鎖不平衡程度，結果表明，3個SNP位點之間均處于連鎖不平衡狀態

表3 三個豬種DRA基因SNP位點基因頻率

Table 3 Frequencies of SNP sites ofDRAgene in three pig breeds

SNPs所處位置Location八眉豬Bameipigs蕨麻豬Juemapigs甘肅黑豬GansuBlackpigsA177G外顯子1Exon1A(041)A(012)A(026)G(059)G(088)G(074)A3093C外顯子2Exon2A(074)A(066)A(063)C(026)C(034)C(037)A4167G外顯子4Exon4A(052)A(037)A(083)G(048)G(063)G(017)A4246G外顯子4Exon4A(016)A(011)A(000)G(084)G(089)G(100)C4282T外顯子4Exon4C(052)C(043)C(090)T(048)T(057)T(010)G4293A外顯子4Exon4G(100)G(097)G(037)A(000)A(003)A(063)

表4DRA基因3個SNP位點單倍型構建及頻率

Table 4 Haplotype frequency of three SNP sites inDRAgene

單倍型HaplotypeA3093CA4167GG4293A頻率FrequencyH1AAG025H2AAA005H3AGG021H4CAG012H5CAA018H6CGG021

(表5)，其中A4167G和G4293A之間的連鎖不平衡程度最高。

表5DRA基因3個SNP位點之間的連鎖不平衡參數估計

Table 5 Analysis into linkage disequilibrium parameters among three SNP sites inDRAgene

參數ParameterA3093C?A4167GA3093C?G4293AA4167G?G4293Ar2000100720151D′003305991

圖6 DRA基因各單倍型mRNA二級結構Fig.6 Secondary structure of haplotypes in DRA gene

2.7DRA基因mRNA二級結構預測結果

預測野生型和本研究所構建的單倍型的mRNA二級結構，結果如圖6所示。野生型和H1的mRNA二級結構自由能為-1 008.22 kJ·mol-1，H2和H3自由能有所增大，分別為-1 007.38和-1 006.96 kJ·mol-1，而H4、H5和H6自由能有所減小，H4和H5均為-1 011.98 kJ·mol-1，H6為-1 010.72 kJ·mol-1。

2.8 DRA蛋白二級結構和三級結構預測

DRA基因各單倍型蛋白的二級結構預測結果見表6。由表中數據可知，無規則卷曲是所有單倍型DRA蛋白二級結構中的主要元件，與野生型蛋白質二級結構相比，H4結構中各組成沒有變化，H2和H5的延伸鏈比例降低而無規則卷曲比例增大，H3和H6的α螺旋比例增大而延伸鏈比例降低。DRA基因各單倍型蛋白的三級結構預測結果如圖7所示，各單倍型三級結構與野生型并不能完全重合，存在一定的差異。

表6DRA基因各單倍型蛋白二級結構預測結果

Table 6 Putative results of secondary structure of DRA protein before and after mutation

突變位點Mutationsiteα螺旋Alphahelix/%延伸鏈Extendedstrand/%β轉角Betaturn/%無規則卷曲Randomcoil/%野生型Wildtype/H1246030568733611H2246030168733651H3254029768733611H4246030568733611H5246030168733651H6254029768733611

螺旋狀, α-螺旋; 片狀, β-折疊; 線形, β-轉角和無規則卷曲Heliciform, alpha helix; Sheet, β-sheet; Linear, beta turn and random coil圖7 DRA蛋白三級結構預測結果Fig.7 Putative result of tertiary structure of DRA protein

3 討論

MHC基因的一個顯著特征就是具有高度多態性。多態性是指同一基因位點在同一隨機交配的群體中可存在兩個或兩個以上的等位基因，有時甚至可達到幾十個或者幾百個等位基因。MHC出現高度多態性的原因很多，如基因缺失、重復、倒位、顛倒、轉換等，突變基因可能經過長期的自然選擇從而形成新的等位基因。SLA-DRB和DQB具有高度多態性，DQA屬于中度多態基因，而DRA基因的多態性較低[6]。迄今為止，MHC-IPD數據庫(http://www.ebi.ac.uk/ipd.htmL)收錄的SLA-DRA等位基因僅有13個。本研究在蕨麻豬DRA基因的外顯子1、2和4上分別檢測到1、1和4個SNP位點，而在八眉豬和甘肅黑豬3個外顯子上分別檢測到1、1和3個SNP位點，證實了DRA基因較低的多態性。與前人研究結果對比發現，本研究三個豬種DRA基因的SNP位點數均少于杜洛克、大白豬、長白豬和煙臺黑豬[9-11]，由此可見，八眉豬、蕨麻豬和甘肅黑豬DRA基因的多態性低于其他品種豬。

對豬SLA-DRA基因外顯子區域SNP位點的檢測有助于分析核苷酸突變對該基因功能的影響。基因外顯子區域的核苷酸突變可以導致氨基酸發生變化，從而可能影響該基因的功能，單個氨基酸的改變就能影響跨膜蛋白的功能[18]。SLA-DRA外顯子2的A3093C突變以及外顯子4上的A4167G和G4293A突變為錯義突變，分別導致甲硫氨酸(極性中性氨基酸)變為亮氨酸(非極性疏水性氨基酸)、谷氨酰胺(極性中性氨基酸)變為的精氨酸(堿性氨基酸)以及精氨酸變為組氨酸，這些氨基酸性質的改變有可能最終導致DRA蛋白的某些功能發生變化。

真核生物基因的外顯子編碼蛋白質，外顯子序列上核苷酸突變可能引起mRNA二級結構的變化，進而改變蛋白質高級結構和功能[19]。對SLA-DRA基因錯義突變SNP位點構建的單倍型mRNA二級結構預測結果表明，單倍型H2和H3的mRNA二級結構穩定性變小，而H4、H5和H6的mRNA二級結構穩定性變大，由此可見，G4293A和A4167G突變降低了DRA基因mRNA二級結構穩定性，而A3093C突變增強了DRA基因mRNA二級結構穩定性，且A3093C突變對mRNA二級結構穩定性的增強作用高于G4293A和A4167G突變降低作用。蛋白質二級結構預測結果表明，單倍型H4蛋白二級結構與野生型相同，而H2、H3、H5和H6的蛋白二級結構發生了改變，由此可見，DRA基因外顯子2的A3093C突變并未改變蛋白質的二級結構組成，而外顯子4的A4167G和G4293A突變均對蛋白二級結構產生了影響，研究表明，SLAⅡ類基因α鏈的外顯子4編碼跨膜區和胞內區[4]，DRA基因外顯子4結構的改變有可能影響細胞的抗原呈遞和免疫應答，從而影響機體對某些疾病的抵抗力。各單倍型間的DRA蛋白三級結構存在差異，進一步表明，DRA基因外顯子上的SNP位點可能影響到蛋白質的某些生物學功能。

本研究篩選出的DRA基因3個SNP錯義位點可作為影響豬疾病的候選分子標記，為進一步研究DRA基因對豬某些疾病的調節作用提供基礎參考數據，后期應進一步分析DRA基因SNP位點與豬疾病的關聯性，探討該基因對豬疾病的調控作用。

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(責任編輯 盧福莊)

SNP screening and bioinformatics analysis ofSLA-DRAgene in pigs

LIU Lixia， ZHANG Li， TIAN Xiaojing， CHEN Hong， CUN Haixia， JIN Li， TAN Xiaoyin， XIE Deqiong

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030，China)

The single nucleotide polymorphism (SNP) site of four exons ofSLA-DRAgene in Bamei， Juema and Gansu Black pigs were screened via polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and DNA sequencing analysis， and further secondary structure of mRNA， secondary and tertiary structures of DRA protein were predicted through the bioinformatics tools. The results showed that 6 SNP sites were detected， including A177G， located in exon 1， A3093C, located in exon 2， A4167G, A4246G， C4282T and G4293A， located in exon 4， and among these SNP sites， A3093C， A4167G and G4293A were missense mutation， A3093C led to methionine (Met) into leucine (Leu)， A4167G led to glutamine (Gln) into arginine (Arg)， and G4293A led to arginine (Arg) into histidine (His). Based on the 3 missense SNPs， 6 haplotypes were constructed， in which H1， H3 and H6 were the main haplotypes with frequencies 0.25， 0.21 and 0.21， respectively. The results of bioinformatics showed that secondary structure of mRNA， secondary and tertiary protein structures ofDRAhaplotypes in three pigs were different from those in wild type. The consequence would provide basis for study of breed conservation and molecular breeding in disease resistance for Bamei， Juema and Gansu Black pigs.

pig;SLA-DRA; SNP site; bioinformatics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.04

2016-11-16

甘肅省農牧廳生物技術專項(GNSW-2008-04)；西北民族大學引進人才項目(xbmuyjrc201408)；西北民族大學中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(31920170029)

劉麗霞(1983—)，女，甘肅隴南人，博士，高級實驗師，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail: skllx@xbmu.edu.cn

S852.4；Q751

A

1004-1524(2017)07-1077-09

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1077-1085

劉麗霞，張麗，田曉靜，等. 豬SLA-DRA基因SNP位點篩選及其生物信息學分析[J]. 浙江農業學報， 2017，28(7): 1077-1085.