蘋果YABBY基因家族的鑒定、進化及表達分析

邵紅霞，陳鴻飛，張 東，吳海芹，趙彩平，韓明玉

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

蘋果YABBY基因家族的鑒定、進化及表達分析

邵紅霞，陳鴻飛，張 東，吳海芹，趙彩平，韓明玉*

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

從蘋果全基因組范圍內共鑒定出13個YABBY基因，通過聚類分析將其分為YAB1/YAB3、YAB2、INO、YAB5和CRC 5個亞家族。MdYABBY基因分布在蘋果的9條染色體上，在第16條染色體上分布最多。MdYABBY蛋白長度介于60～538個氨基酸，等電點為4.84～9.81，所有MdYABBY蛋白都包含有鋅指結構和YABBY 兩個保守結構域，同一個亞家族內的成員表現出相似的基因結構和蛋白保守基序分布；基因順式作用元件分析發現，MdYABBY基因包含許多與抗逆和激素響應有關的作用元件。基因表達分析發現，MdYABBY基因在花、果和葉中的表達量較高，5個MdYABBY基因在果實發育的3個時期均明顯地上調表達。

蘋果；YABBY基因；聚類分析；進化；基因表達

轉錄因子能夠特異識別并結合于靶基因上游啟動子區域的特異DNA序列模體，使其轉錄激活或抑制，從而調節植物的生長發育[1-2]。根據轉錄因子蛋白質序列中特異DNA結合域的不同，可以將轉錄因子分為不同的家族[3-4]。一些轉錄因子同時存在于植物和動物，如HB(同源異型盒蛋白)、HSF(熱激轉錄因子)等；也有一些轉錄因子是植物特有的，比如WRKY轉錄因子[5]、YABBY轉錄因子[6-7]。其中，YABBY轉錄因子包含2個保守結構域：N端的鋅指結構域和C端的YABBY結構域[8]；除鋅指結構域和YABBY結構域以外，不同亞家族基因編碼的蛋白通常還具有以該亞家族為特點的其他保守結構域[9]。在擬南芥、西紅柿等植物中，YABBY基因家族包含5個亞族，分別為CRABS CLAW(CRC)、FILAMENTOUS FLOWER(FIL)/YABBY3(YAB3)、INNER NO OUTER(INO)、YABBY2(YAB2)和YABBY5(YAB5)，而水稻中只包含4個亞族，沒有YABBY5(YAB5)亞家族。同一亞族內YABBY基因在進化過程中往往發生功能分化[10-12]。此外，擬南芥、水稻和番茄等被子植物中許多YABBY基因的發現為研究YABBY基因家族的進化提供了重要參考價值[12]。

大量的研究表明，YABBY轉錄因子能夠決定植物側生器官遠軸面細胞命運[13]，并與葉和花等器官的形態建成有關[6，14]。擬南芥中共鑒定出6個YABBY基因家族成員，分別為FILAMENTOUSFLOWER(FIL)、YABBY3、CRABSCLAW(CRC)、INNERNOOUTER(INO)、YABBY2和YABBY5[15]。其中，FIL在植物花器官發育過程中發揮重要作用[16-18]，CRC跟蜜腺大小和心皮極性有關[19-20]，INO參與外珠被的發育[21]，YAB2和YAB3在側生器官的遠軸面表達[22]。

蘋果被譽為溫帶水果之王，與人們生活和國民經濟密不可分。然而，YABBY蛋白作為一類影響植物生長發育的重要調控因子，在蘋果中研究還比較少。本研究中，在蘋果全基因組范圍內共鑒定出13個YABBY基因家族成員，并對它們的基因復制、基因結構、蛋白保守基序、順式作用元件、組織特異性和在果實發育中的表達特性等做了研究，以期為進一步深入探索蘋果YABBY基因家族的功能提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 蘋果YABBY基因的鑒定

在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載包含YABBY結構域的多重序列比對文件(PF04690)，并以此文件構建HMM模型(隱馬爾科夫模型)。從GDR(Genome Database for Rosaceae)數據庫(http://www.phytozome.net/apple)下載金冠蘋果全基因組序列[23]。然后用HMMER 2.0[24]軟件包在蘋果全基因組范圍內進行YABBY家族成員的搜索(e≥0.01)。為了進一步確保搜索的準確性，對得到的所有蘋果YABBY家族候選成員用Pfam(http://pfam.xfam.org/search/sequence)和NCBI Conserved Domains Database(NCBI CDD， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)數據庫進行YABBY蛋白保守結構域預測(e≥0.01)[25]。最后，在蘋果全基因組范圍內共鑒定出13個YABBY基因。

1.2 蘋果YABBY基因的系統進化分析

依據前人對擬南芥、玉米、水稻和西紅柿YABBY基因的鑒定結果[14，26，11，27]，分別在The Arabidopsis Information Resource(TAIR，http://www.Arabidopsis.org/index.jsp)、V3版玉米自交系B73參考基因組數據(http: //plants. Ensembl.org /Zea_mays /Info /Index)、National Center for Biotechnology Information(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Sol Genomics Network (https://solgenomics.net/)下載擬南芥、玉米、水稻和西紅柿的YABBY蛋白序列，然后利用MAGE 5.0軟件對來自5個物種的共49個YABBYA蛋白構建系統發育樹。生成算法采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，校驗參數采用Bootstrap重復1 000次。

1.3 蘋果YABBY基因的復制和染色體位置

從AppleGFDB(http://www.applegene.org/)下載蘋果YABBY基因的染色體位置信息，用MapInspect軟件作圖。利用DNAMAN軟件[28]分別對13個蘋果YABBY的基因和蛋白序列進行多重序列比對，依據比對結果鑒定蘋果YABBY基因旁系同源對。旁系同源對基因須滿足以下2個條件：(1)兩基因序列對齊之后，短基因序列比長基因序列的覆蓋率大于70%。(2)兩基因蛋白序列的一致性大于70%[29-30]。

1.4 蘋果YABBY基因的結構、保守基序分析

利用在線Gene Structure Display Server(GSDS， http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具對蘋果YABBY基因結構進行分析。利用在線MEME 4.11.1(http://meme-suite.org/)工具對蘋果YABBY蛋白序列進行保守基序搜索，除最大保守基序數量為10個以外，其他參數均為默認設置。

1.5 蘋果YABBY蛋白的理化性質和多重序列比對分析

用ExPaSy提供的在線Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)軟件進行蛋白長度、分子量、理論等電點、不穩定系數、脂肪族氨基酸指數和蛋白質疏水性分析。利用DNAMAN軟件[28]對13個蘋果YABBY蛋白和6個擬南芥YABBY蛋白進行多重序列比對，參數采用系統默認數值。

1.6 蘋果YABBY基因的順式作用元件分析

從金冠蘋果全基因組序列中獲取YABBY基因起始密碼子(ATG)上游1 500 bp的DNA序列，利用在線PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行分析，采用默認參數設置。

1.7 蘋果YABBY基因的表達特性分析

從The European Bioinformatics Institute(EBI，http://www.ebi.ac.uk/)芯片數據庫下載金冠以及不同蘋果雜交種不同器官的基因表達數據(E-GEOD-42873)，提取MdYABBY基因表達量；同樣在EBI芯片數據庫下載果實發育芯片數據(E-GEOD-24523)及其探針序列(A-GEOD-11164)，構建探針序列的本地blast數據庫，然后利用蘋果YABBYCDS序列進行比對，選取e=0且DNAMAN軟件比對之后完全匹配的探針代表該YABBY基因，提取MdYABBY基因表達量。最后，采用Mev_4_9_0軟件進行聚類并作圖分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果YABBY基因的鑒定

通過生物信息學分析，本研究共獲得13個蘋果YABBY基因家族成員(表1)，根據它們的染色體位置信息，將得到的13個蘋果YABBY基因依次命名為MdYABBY1 ～MdYABBY13。對MdYABBY基因和MdYABBY蛋白的理化性質進行分析后發現，MdYABBY基因的CDS序列長度介于183(MdYABBY11)～1 617 bp(MdYABBY6)；MdYABBY蛋白包含60(MdYABBY11)～538(MdYABBY6)個氨基酸，分子量為6 691.5(MdYABBY11)～59 846.3 u(MdYABBY6)，等電點介于4.84(MdYABBY13)～9.81 (MdYABBY11)。進一步研究發現，所有預測的MdYABBY蛋白的GRAVY值均為負值，即MdYABBY蛋白都是親水蛋白，只是親水程度不同。13個MdYABBY蛋白成員中只有MdYABBY1，MdYABBY10和MdYABBY11的不穩定

表1 蘋果YABBY基因家族

Table 1 YABBY gene family in apple

類別Group基因編號GeneNo．基因組登錄號GeneaccessionNO．長度LengthofCDS/bp大小Size/aa分子量Molecularweight/u等電點pI不穩定系數Instabilityindex脂肪族氨基酸指數Aliphaticindex蛋白質疏水性HydrophobicityCRCMdYABBY8MDP000017187862120622447487249155354-0573MdYABBY11MDP0000124879183606691598128144917-0887MdYABBY12MDP000029172954918220182985242685791-0594YAB1/YAB3MdYABBY5MDP000019294065721824336582643757417-0424MdYABBY4MDP000029833359119622116388841087158-0499MdYABBY3MDP000036629188229533396086346957139-0576MdYABBY2MDP000050081076825528580287049757263-0485YAB2MdYABBY7MDP000033180855218520438790252886276-0585MdYABBY6MDP0000252640161753859846384140038032-0328YAB5MdYABBY1MDP000025541556718821255276139906543-0588MdYABBY10MDP000026143245014916422667835676745-0394INOMdYABBY13MDP000012622166322024892348451747268-0438MdYABBY9MDP0000263713132043949820191047567194-0564

系數小于40，證明大部分MdYABBY蛋白都是不穩定蛋白。這些分析結果可以進一步為MdYABBY蛋白的提純、活性和功能研究提供理論基礎。

2.2 蘋果YABBY基因的復制和染色體定位分析

根據13個MdYABBY基因在染色體上的位置信息，利用MapInspect工具進行染色體定位作圖。所有的MdYABBY基因都能找到相匹配染色體定位信息，共分布在9條染色體上(分別為染色體2、5、6、9、10、11、13、15和16)(圖1)。其中，16號染色體分布3個，是富集MdYABBY基因最多的染色體，在第2和13號染色體上均分布2個MdYABBY基因，其他染色體分別僅有1個MdYABBY基因分布。另外，共鑒定出3組基因復制對(MdYABBY1/MdYABBY10、MdYABBY8/MdYABBY12、MdYABBY4/MdYABBY5)。

2.3YABBY基因系統進化樹的構建和蛋白多重序列比對

為了研究MdYABBY基因的系統進化關系，利用MAGE 5.0軟件構建了一個包含擬南芥、番茄、蘋果、水稻和玉米5個物種YABBY基因的系統發育樹(圖2)。發現蘋果YABBY家族與擬南芥、玉米、水稻和番茄的相似性較低，而蘋果YABBY家族成員之間有明顯的對應關系，比如，MdYABBY9與MdYABBY13，MdYABBY8與MdYABBY11、MdYABBY12，MdYABBY1與MdYABBY10等。根據它們的系統進化關系，并結合前人對擬南芥、玉米和水稻YABBY基因的系統進化分析[31，12]，將13個MdYABBY基因分為5個亞家族，分別命名為YAB1/YAB3、YAB2、CRC、INO和YAB5。其中，YAB1/YAB3包含的家族成員數量最多，有4個家族成員(MdYABBY2、MdYABBY3、MdYABBY4和MdYABBY5)，CRC包含有3個家族成員(MdYABBY8、MdYABBY11和MdYABBY12)；YAB2、YAB5和INO都分別只包含2個家族成員。

為了研究YABBY蛋白序列的特征，用DNAMAN軟件對蘋果和擬南芥所有的YABBY蛋白的氨基酸進行多重序列比對分析，結果表明，所有的序列都具有2個相對保守的結構域，即位于N端的鋅指結構域和C端的YABBY結構域(圖3)，這說明YABBY蛋白在不同物種間具有高度保守性。

2.4MdYABBY基因結構與蛋白保守基序分析

利用在線基因結構顯示系統(GSDS)對所有YABBY基因的結構分析發現，MdYABBY基因的外顯子個數從3(MdYABBY12)到11(MdYABBY6)不等。利用MEME工具對所有YABBY家族成員的保守基序進行搜索鑒定，共鑒定出10個保守基序，其中Motif 2和Motif 3代表C2C2型鋅指結構域，Motif 1代表YABBY結構域。同一個亞家族的成員表現出相似的基因結構和蛋白保守基序分布，比如亞家族YAB1/YAB3的成員都含有7個外顯子和Motif 4、Motif 5，且都是由第4～6個外顯子編碼YABBY結構域。亞家族INO中所有成員的YABBY結構域都是由自3′端向5′端為順序的第2、3和4這3個外顯子所編碼，且都包含motif 9和motif 10。進一步分析發現，除MdYABBY10以外，所有成員的YABBY結構域均由3個外顯子編碼；所有編碼YABBY結構域的外顯子均位于基因片段的3′端，所有編碼鋅指結構域的外顯子位于基因片段的5′端。上述結果表明，無論是基因結構還是蛋白保守基序，MdYABBY基因家族都有一定的保守性。

圖1 MdYABBY基因在染色體上的位置Fig.1 Chromosomal locations of MdYABBY genes

圖2 蘋果、水稻、玉米、番茄和擬南芥YABBY轉錄因子的系統發育樹Fig.2 An unrooted phylogenetic tree of YABBY transcription factors in apple， rice， maize， tomato and Arabidopsis

圖3 蘋果和擬南芥YABBY蛋白保守結構域氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of YABBY protein conserved domains in apple and Arabidopsis

2.5MdYABBY基因的順式作用元件分析

基因的表達依賴于順式作用元件和反式作用因子的相互作用，通過分析啟動子及其上游序列的順式作用元件能夠預測基因的功能。對13個蘋果YABBY基因的順式作用元件進行分析發現，YABBY基因含有大量與光響應和胚乳表達相關的順式作用元件，其次，含有許多與抗逆(干旱和低溫響應等)和激素響應(脫落酸和赤霉素誘導等)有關的作用元件(圖5)。

圖4 MdYABBY基因結構與蛋白基序分配Fig.4 Gene structures of MdYABBY genes and schematic diagram of conserved motifs of MdYABBY proteins

1， 光響應；2， 分生組織表達與激活；3， 胚乳表達；4， 種子特異性調控；5， 芽特異表達和光響應；6， 抗病和脅迫誘導；7， 玉米醇溶蛋白代謝調控；8， 脫落酸誘導；9， 茉莉酸甲酯誘導；10， 水楊酸誘導；11， 赤霉素誘導；12， 生長素誘導；13， 乙烯響應；14， 干旱誘導；15， 低溫響應；16， 熱脅迫響應；17， 晝夜節律調控1， light-responsiveness; 2， meristem expression and specific activation; 3， endosperm expression; 4， Seed-specific regulation; 5， shoot-specific expression and light responsiveness; 6， defense and stress responsiveness; 7， zein metabolism regulation; 8， abscisic acid responsiveness; 9， MeJA-responsiveness; 10， salicylic acid responsiveness; 11， gibberellin-responsiveness; 12， auxin-responsiveness; 13， ethylene-responsiveness; 14， drought-inducibility; 15， low-temperature responsiveness; 16， heat stress responsiveness; 17， circadian control圖5 MdYABBY基因順式作用元件Fig.5 The cis-acting elements of MdYABBY genes

2.6MdYABBY基因在不同品種蘋果中的表達

為了研究MdYABBY基因在不同組織中的表達特性，從EBI芯片數據庫下載MdYABBY基因在金冠以及不同雜交種蘋果不同器官的表達數據[32]，并作圖(圖6)。分析發現，MdYABBY7在花、葉以及不同成熟期的果實中表達量均較高，MdYABBY1和MdYABBY10在不同雜交種蘋果花和葉中的表達量較高，MdYABBY8、MdYABBY11和MdYABBY12在不同雜交種蘋果花和果實中的表達量明顯高于其他器官。總體來看，蘋果YABBY家族基因在花、果和葉中的表達量相對較高。

2.7MdYABBY基因在不同果實發育時期的表達

為了進一步研究MdYABBY基因在蘋果果實發育過程中的作用，從EBI芯片數據庫獲取果實發育芯片數據，表達結果如圖7所示。圖中從左到右依次分別代表蘋果品種Honey Crisp(HC)和Crispps Pink(CP)在果實發育過程的3個時期：果實成熟期(week-0)、果實成熟之前2周(week-2)和果實成熟之前4周(week-4)MdYABBY基因的表達情況。結果表明，MdYABBY1、MdYABBY8和MdYABBY10在果實發育的3個時期表達量一直較低，而MdYABBY2、MdYABBY3、MdYABBY6、MdYABBY7和MdYABBY9在不同品種果實發育的3個時期表達量均比較高。

GD， 金冠；MM67、M74、M20、X8877、M14、M49、X4102、X4442和X3069為不同蘋果雜交種GD， Golden Delicious; M67， M74， M20， X8877， M14， M49， X4102， X4442 and X3069 are various apple hybrids圖6 MdYABBY基因在不同品種蘋果不同器官中的表達Fig.6 The expresstion levels of MdYABBY genes in various apple organ systems

圖7 蘋果YABBY家族基因在果實成熟過程中的表達Fig.7 Expression profile of the MdYABBY family genes during fruit development in apple

3 討論

YABBY蛋白是植物特有的一類轉錄因子，其家族成員已在不同物種中被鑒定出來。其中，在擬南芥、水稻、大白菜、玉米和西紅柿中分別鑒定出6[33]、8[12]、11[34]、13[26，31]、9個[35]。本研究利用生物信息學方法，首次在蘋果全基因組范圍內鑒定出13個YABBY基因，發現YABBY基因家族成員在不同物種中的數量較少。根據13個MdYABBY基因的系統進化關系將其分為5個亞家族，其中，YAB1/YAB3亞家族包含的MdYABBY基因數量最多，這些與水稻、玉米等其他物種中的結論一致。除此之外，無論單純在蘋果這一物種內的橫向比較，還是在蘋果和擬南芥2個物種間的縱向比較，同一個亞家族內基因成員的基因結構以及蛋白保守基序的分布都具有一定的保守性。

大量的研究表明，YABBY基因在植物側生器官發育過程中具有重要的作用[36-38]。例如，在擬南芥和金魚草的研究中發現，YABBY基因涉及一個產生于側生器官并能夠影響分生組織活動的信號[39-41]；在水稻中發現，YABBY家族成員在種子、花器官和葉發育過程中均有表達[12]；在西紅柿中，YABBY家族成員在花、營養組織和果實前期發育中均有表達[35]。此外，YABBY轉錄因子還能夠分別與LEUNIG(LUG)和SEUSS(SEU)互作，從而形成抑制因子復合體(LUG是擬南芥花同源異型基因的阻遏物，SEU是LUG的輔調節蛋白)[41-42]。

本研究發現，YABBY基因含有大量的激素誘導和植物逆境響應相關順式作用元件，表明MdYABBY基因可能與植物激素信號轉導和植物逆境響應密切相關，特別是赤霉素、脫落酸和乙烯等激素誘導相關作用元件和胚乳表達有關作用元件的發現，推測MdYABBY基因可能與蘋果花發育和果實有關。對13個MdYABBY基因在金冠以及不同雜交種蘋果不同器官的表達特性作了系統分析，結果發現，MdYABBY基因明顯地在花、果和葉等側生器官中上調表達。這進一步暗示了MdYABBY基因與擬南芥YABBY基因類似，它們在側生器官比如花、果和葉等發育過程中發揮著一定的作用。值得一提的是，MdYABBY基因在不同的蘋果雜交種相同的器官中表達有差異，比如MdYABBY基因在雜交種M20幼果中的表達量較成熟果高，而在M74中的表達情況卻恰恰相反，但總體上，MdYABBY基因在蘋果果實中的表達量比較高；基于此，關于YABBY基因在蘋果某一品種或雜交種中具體的功能還需做專門的、更具針對性的深入研究。為了初步驗證我們的猜想，從EBI芯片數據庫下載果實不同發育期芯片數據，可以發現5個基因(MdYABBY2、MdYABBY3、MdYABBY6、MdYABBY7和MdYABBY9)在不同品種果實發育過程的3個時期表達明顯上調。有研究指出，SlYABBY1a在調控西紅柿果實形狀和大小中發揮著重要的作用，SlYABBY2a在西紅柿果實馴化過程中能夠調控極端的果實大小[27]。從系統發育樹上看，蘋果中與SlYABBY1a和SlYABBY2a同源關系最近的基因分別為MdGATA2、MdGATA3以及MdGATA6、MdGATA7，這4個基因在蘋果果實發育的3個階段都有較高的表達，推測這些基因也會發揮類似的功能。這些結果初步證明了MdYABBY基因在蘋果果實發育過程中可發揮一定的作用。進一步確認和深入分析MdYABBY基因如何在蘋果果實發育過程中發揮功能，還需大量系統深入的分子生物學試驗驗證和結果分析，MdYABBY基因能否在花和葉等其他側生器官發育的不同時期發揮不同的作用也需要進一步深入探索。

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(責任編輯 侯春曉)

Identification， evolution and expression analysis of the YABBY gene family in apple (Malus×domesticaBorkh.)

SHAO Hongxia， CHEN Hongfei， ZHANG Dong， WU Haiqin， ZHAO Caiping， HAN Mingyu*

(CollegeofHorticulture，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

13Malus×domesticaYABBYgenes were characterized and divided into five groups (YAB1/YAB3， YAB2， INO， YAB5 and CRC). All theM.domesticaYABBYgenes distributed on nine chromosomes in which the sixteenth contained the maximum amount of members. The length and isoelectric points ofM.domesticaYABBY proteins were from 60 to 538 amino acids and 4.84 to 9.81， respectively. All the 13M.domesticaYABBY proteins had a zinc finger-like domain in the N terminus and a YABBY domain in the C terminus， and the members of one subgroup present similar gene structure and conserved protein motifs， then thecis-elements analysis found that there were manycis-elements related to stress and hormone response. Gene expression analysis indicated that most of theM.domesticaYABBYgenes were highly expressed in flower， fruits and leaves. FiveMdYABBYgenes were all greatly up-regulated during three fruit development.

apple;YABBYgene; cluster analysis; evolution; gene expression

http://www.zjnyxb.cn邵紅霞， 陳鴻飛， 張東， 等. 蘋果YABBY基因家族的鑒定、進化及表達分析[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(7): 1129-1138.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.10

2017-02-27

國家科技支撐計劃項目(2013BAD20B03)；國家星火計劃項目(2014GA850002)；國家現代農業產業技術體系項目(CARS-28)，國家蘋果改良中心楊凌分中心，陜西省農業科技創新與攻關項目(2015NY114)；陜西省果業發展協同中心和陜西果業發展項目

邵紅霞(1991—)，女，陜西定邊人，碩士研究生，研究方向為蘋果花芽分化機制。E-mail: xnyyshx@163.com

*通信作者，韓明玉，E-mail: hanmy@nwsuaf.edu.cn

S661.1

A

1004-1524(2017)07-1129-10

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1129-1138