超聲波提取毛酸漿總黃酮研究

牛春艷，王海

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林132101）

超聲波提取毛酸漿總黃酮研究

牛春艷，王海

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林132101）

以毛酸漿果實(shí)為原料，超聲提取其中的總黃酮。經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析，研究乙醇濃度、超聲時(shí)間、固液比、超聲溫度對毛酸漿總黃酮提取率的影響，從而得到最佳提取條件：乙醇濃度60%、超聲時(shí)間30min、固液比1：30、超聲溫度40℃，此時(shí)總黃酮提取率最高，為5.77%。

超聲波；毛酸漿；總黃酮

毛酸漿（Physalispubescens L.）也被稱為洋菇娘、黃菇娘，在我國，毛酸漿主要分布于我國東北地區(qū)，吉林省與黑龍江省產(chǎn)量居多。毛酸漿漿果柔嫩多汁，具有清香可口氣味和酸甜淡雅的口感。毛酸漿漿果具有一定的藥用價(jià)值，有降低血壓、解除肌肉疼痛與疲憊、對動(dòng)脈硬化和心血管疾病具有預(yù)防與保護(hù)等功效[1]。毛酸漿中含有黃酮類與生物堿[2]，此外還有多種脂溶性油狀成分，如醛類、酯類、有機(jī)酸等，其果實(shí)中還含有豐富的維生素C、檸檬酸、類胡蘿卜素與多種礦物質(zhì)和人體需要的氨基酸[3-4]。黃酮（flavone）為黃酮類化合物的總稱，擁有多種生物活性，大多黃酮類化合物都有較強(qiáng)的抗氧化自由基活性，它能夠有效清除體內(nèi)的自由基[5-6]。本試驗(yàn)以毛酸漿果實(shí)為原料，以乙醇作為提取溶液，超聲提取黃酮。通過一系列試驗(yàn)，確定最佳工藝，提取毛酸漿總黃酮，為毛酸漿的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛酸漿鮮果（市售）、蘆丁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、維生素C等試劑均為分析純試劑（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品營養(yǎng)分析實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-721可見分光光度計(jì)（上海欣茂科技儀器有限公司）；FA2103型電子分析天平（北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司）；KQ-100DE型高頻超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；800B型臺式離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）；FLB-200A型萬能高速粉碎機(jī)（上海市菲力博食品機(jī)械公司）；DHG-9420B型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（深圳愛特爾電子科技有限公司）。

1.3 毛酸漿中總黃酮的提取

1.3.1 工藝流程

1.3.2 毛酸漿總黃酮提取率

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的制備：準(zhǔn)確稱取0.1250g蘆丁標(biāo)品，溶解在60%的乙醇，如溶解不充分，可適當(dāng)水浴促使其加速溶解，溶解后全部轉(zhuǎn)移至250mL的容量瓶中，加入60%乙醇定容到刻度，搖勻，得到的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液（其濃度為0.5mg/mL），儲存、備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別準(zhǔn)確移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液置于25mL容量瓶中，添加0.7mL 5%的NaNO2溶液，充分搖晃，靜置5min，添加0.7mL 10%的Al（NO3）3溶液，充分搖晃，靜置5min，再添加5mL 1mol/L的NaOH溶液，用60%乙醇定容到刻度線，充分搖晃，靜置15min（制得濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ mL蘆丁溶液），用紫外分光光度計(jì)在最大吸收波長（λmax=510nm）處測定吸光度值。用60%乙醇作參比溶液，吸光值—縱坐標(biāo)，蘆丁—橫坐標(biāo)，制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)R2。

（2）總黃酮提取率的計(jì)算

采取硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法，取毛酸漿總黃酮提取液1mL置于100mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度。在相同條件下于λmax= 510nm處測定其吸光值，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，由此計(jì)算毛酸漿總黃酮提取液的質(zhì)量濃度，經(jīng)換算后得毛酸漿總黃酮提取率σ，其計(jì)算公式為：

式中：α—毛酸漿總黃酮提取液稀釋倍數(shù)；

V—毛酸漿總黃酮提取液原有體積，mL；

C—毛酸漿總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；

M—所用毛酸漿的質(zhì)量，mg。

1.4 單因素試驗(yàn)

經(jīng)過查閱有關(guān)文獻(xiàn)與預(yù)實(shí)驗(yàn)，影響提取率的因素主要是：乙醇濃度，超聲時(shí)間，固液比和超聲溫度，為確定毛酸漿總黃酮的最佳提取工藝條件，需先通過單因素試驗(yàn)及其散點(diǎn)折線圖進(jìn)行分析，后通過正交試驗(yàn)及其數(shù)據(jù)極差分析確定最佳提取工藝。

1.4.1 乙醇濃度對毛酸漿總黃酮提取率的影響精密稱取毛酸漿粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的條件下，分別加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，然后放在超聲波清洗機(jī)中，控制超聲輔助提取溫度40℃，超聲輔助提取30min。

1.4.2 超聲時(shí)間對毛酸漿總黃酮提取率的影響精密稱取毛酸漿粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的條件下，加入60%的乙醇溶液，然后放在超聲波清洗機(jī)中，控制超聲輔助提取溫度40℃，分別超聲輔助提取10、20、30、40、50min。

1.4.3 固液比對毛酸漿總黃酮提取率的影響精密稱取毛酸漿粉末3.00g，共5份，固液比分別在1：10、1：15、1：20、1：25、1：30的條件下加入60%乙醇溶液，然后放在超聲波清洗機(jī)中，控制超聲輔助提取溫度40℃，超聲輔助提取30min。

1.4.4 超聲溫度對毛酸漿總黃酮提取率的影響精密稱取毛酸漿粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的條件下，加入60%的乙醇溶液，然后放在超聲波清洗機(jī)中，分別控制30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的超聲輔助提取溫度，超聲輔助提取30min。

1.5 正交試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其數(shù)據(jù)分析原理，分別考察乙醇濃度、超聲時(shí)間、固液比和超聲溫度4個(gè)因素（每組3個(gè)平行）對毛酸漿總黃酮提取率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

采用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法顯色，于在λmax=510nm波長處用721紫外分光光度計(jì)測定吸光度值。以60%乙醇為參比溶液，橫坐標(biāo)為蘆丁濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程經(jīng)過計(jì)算得：Y=11.53X-0.0075，R2=0.9995，λmax=510nm處測得蘆丁吸光值，X—蘆丁標(biāo)液的濃度（mg/mL），結(jié)果顯示線性關(guān)系呈現(xiàn)良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 乙醇濃度對毛酸漿總黃酮提取率的影響選定超聲溫度為40℃、固液比為1：20、提取時(shí)間為30min，以乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%5個(gè)水平）作為考察對象，考察乙醇濃度對提取率的影響（見圖2）。

圖2 乙醇濃度對毛酸漿總黃酮提取率的影響

圖2顯示，乙醇濃度在30%~60%的范圍內(nèi)，毛酸漿總黃酮提取率隨濃度的加大而升高，乙醇濃度60%，毛酸漿總黃酮提取率最大值；當(dāng)乙醇濃度再增大時(shí)，提取率卻下降了。這可能是因?yàn)槊釢{黃酮中存在酚羥基，酚羥基是活性基團(tuán)，與水、乙醇形成氫鍵；而乙醇濃度亦不能太大，否則適得其反，會造成非目標(biāo)提取成分的溶出，加大后期分離純化的難度。所以，選定乙醇濃度為50%～70%。

2.2.2 超聲時(shí)間對毛酸漿總黃酮提取率的影響選定超聲溫度為40℃、乙醇濃度為60%、固液比為1：20，以超聲時(shí)間（10、20、30、40、50min 5個(gè)水平）作為考察對象，考察超聲時(shí)間對提取率的影響（見圖3）。

圖3 超聲時(shí)間對毛酸漿總黃酮提取率的影響

圖3顯示，超聲作用時(shí)間越長毛酸漿總黃酮提取率先增加，然后隨之而減少，當(dāng)超聲時(shí)間10～30min范圍內(nèi)，呈現(xiàn)上升的走勢，超聲時(shí)間30min后，其提取率最高，隨后，毛酸漿總黃酮的提取率都出現(xiàn)下降。因?yàn)槌曁崛r(shí)間過長，黃酮分子和其他物質(zhì)反應(yīng)加強(qiáng)，使黃酮遭到破壞，也會使其暴露于空氣之中時(shí)間過長，使之氧化加深，使得毛酸漿總黃酮含量降低。選定超聲提取時(shí)間為20～40min。

2.2.3 固液比對毛酸漿總黃酮提取率的影響選定乙醇濃度為60%、超聲溫度為40℃、超聲時(shí)間為30min，以固液比（l：10、l：15、l：20、1：25、l：30 5個(gè)水平）作為考察對象，考察固液比對提取率的影響（見圖4）。

圖4 固液比對毛酸漿總黃酮提取率的影響

圖4顯示，固液比1：10～1：25時(shí)，固液比增加，提取率加大，1：25后，提取率下降，分析原因，隨著固液比中乙醇用量的增加，與毛酸漿粉末接觸面的濃度差增大，毛酸漿總黃酮就容易滲透出來，從而加快了溶質(zhì)的擴(kuò)散速度，浸出速度也隨之提高，從而使黃酮提取率也隨之大幅度提高。乙醇用量繼續(xù)加大，提取劑損耗加大，同時(shí)導(dǎo)致一些粘液類、樹脂成分大量溶出，附著于毛酸漿粉末表面，減慢了黃酮類物質(zhì)的浸出速度，同時(shí)加大了分離、純化、濃縮的難度。從提取效果和節(jié)約溶劑用量等方面綜合考慮，選定固液比考查范圍為1：20～1：30（g/mL）。

2.2.4 超聲溫度對毛酸漿總黃酮提取率的影響選定乙醇濃度為60%、超聲時(shí)間為30min、固液比為1：20，以超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃5個(gè)水平）作為考察對象，考察超聲溫度對提取率的影響（見圖5）。

圖5 超聲溫度對毛酸漿總黃酮提取率的影響

圖5顯示，在超聲溫度30～50℃，提取率呈現(xiàn)上升的走勢，但是比較緩慢，溫度達(dá)到50℃時(shí)，提取率趨于平緩或略有下降。其原因可能是超聲溫度升高，分子動(dòng)能高，運(yùn)動(dòng)速度快，黃酮物質(zhì)擴(kuò)散、滲透、溶出速度加快，使其更容易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到提取劑中的緣故。結(jié)合節(jié)能經(jīng)濟(jì)等因素，考查范圍定為40～60℃。

2.3 正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件

2.3.1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)考察乙醇濃度、超聲時(shí)間、固液比和超聲溫度（每組3個(gè)平行）對毛酸漿總黃酮提取率的綜合影響。按L9（34）正交試驗(yàn)表嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，提取毛酸漿總黃酮，經(jīng)分離、稀釋后，測定最大吸收處的吸光度值，從而求得提取率。見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素與水平

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果表見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表2正交試驗(yàn)及其數(shù)據(jù)誤差分析可知，由極差R值可以得到各因素對毛酸漿總黃酮提取率的顯著關(guān)系順序：A＞C＞B＞D，即主要因素為乙醇濃度，其次要因素為固液比和超聲時(shí)間，最后是超聲溫度。毛酸漿總黃酮的最佳提取的工藝參數(shù)為A2B2C3D2，但正交試驗(yàn)結(jié)果中不存在這個(gè)組合，必須通過驗(yàn)證試驗(yàn)，比較這兩種組合，確定最佳條件。結(jié)果顯示A2B2C3D2組合提取率與A2B2C3D1相差不大，根據(jù)操作方便，節(jié)約能源等既定條件，從而確定毛酸漿總黃酮最佳提取工藝條件為A2B2C3D1，乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為30min，固液比為1：30，超聲溫度40℃，在此條件下毛酸漿總黃酮的提取率最高為5.77%。與此進(jìn)行對比，單純采用溶劑浸提法提取毛酸漿總黃酮，其最佳提取工藝條件乙醇濃度為70%，浸提時(shí)間為3h，固液比為1：40，浸提溫度70℃，提取率最高為3.89%。在與傳統(tǒng)的溶劑浸提法相比之中，超聲波輔助提取法體現(xiàn)出耗能低、效率高、不破壞有效成分、雜質(zhì)少、無需高溫、安全性好、操作簡便易行等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在提取毛酸漿的總黃酮中，使用超聲波，并且通過單因素試驗(yàn)，考察乙醇濃度，超聲時(shí)間，固液比和超聲溫度，隨后正交試驗(yàn)。結(jié)果顯示：乙醇濃度對毛酸漿總黃酮提取率的影響是最大的，超聲時(shí)間次之，隨后是固液比和超聲溫度。由此得到最佳工藝條件：A2B2C3D1，即乙醇濃度60%、超聲時(shí)間30min、固液比1：30、超聲溫度40℃，在此這種條件下毛酸漿總黃酮的提取率最高為5.77%。在食品等領(lǐng)域中毛酸漿總黃酮應(yīng)用價(jià)值很高，是安全的抗氧化劑，并且能開發(fā)為功能性食品。

[1]豐利，高倩倩.酸漿和甜菇娘的營養(yǎng)成分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（33）：16113-16114.

[2]古勇，李安明.類黃酮生物活性的研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2013，12（2）：283-286.

[3]韓公羽，沈企華，韓紹雯.植物藥黃酮成分與生理生化活性[M].北京：中國書籍出版社，2010：1-3.

[4]熊雙麗，李安林.夏枯草總黃酮提取分離與自由基清除活性研究[J].食品科學(xué)，2010，31（22）：102-104.

[5]鄭義，邵穎，陳安徽，等.益智仁總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2014，35（6）：44-49.

[6]陳永剛，劉曉涵，林勵(lì).超聲法提取化橘紅中黃酮類物質(zhì)工藝優(yōu)選[J].中藥材，2009，32（1）：138-142.

責(zé)任編輯：吳艷玲

Study on the Extraction of Total Flavonoids from Physalispubescens by UltrasonicW ave

NIU Chunyan,WANG Hai

（Jilin AgriculturalScience and Technology University,SchoolofFood Engineering,Jilin 132101）

In this paper,with the fruits of Physalispubescens as raw materials,itaims to use themethod of ultrasonic in the extraction of the Physalis pubescens of total flavonoids.Through single factor test and orthogonal test,the effects of ethanol concentration,ultrasonic temperature,solid-liquid and ratioultrasonic time,on the extraction rate of the Physalispubescens extractwere studied.The optimum technological condition is like this:60%of ethanol concentration,30 minutes ultrasonic time,1:30－solid-liquid ratio,40℃－ultrasonic temperature.Under this condition,theextraction rate of total flavonoidswas thehighest,at5.77%.

ultrasonic;Physalispubescens;total flavonoids

R 284.2

A

2016-08-20

牛春艷（1981-），女，吉林省乾安縣人，講師，從事活性成分制備與應(yīng)用方面研究。