不同大孔吸附樹脂對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分分離富集的影響

郝彩琴，陳海燕，郭 超，徐 超

（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 750002）

不同大孔吸附樹脂對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分分離富集的影響

郝彩琴，陳海燕，郭 超，徐 超

（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 750002）

目的：從10種不同極性的大孔吸附樹脂中，優(yōu)選對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分吸附和解吸附能力較強(qiáng)的大孔吸附樹脂。方法：以龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量為指標(biāo)，采用靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸附相結(jié)合的方法，優(yōu)選出最佳分離純化樹脂。結(jié)果：XDA-1大孔吸附樹脂宜于對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分分離純化，其對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分的吸附比為：35.385 mg/mL，洗脫率為：97.20%，洗出固形物的量為：455.597 mg，環(huán)烯醚萜苷類化合物在固形物中的含量為：75.48%。結(jié)論：XDA-1對秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分分離富集具有較好的效果。

大孔吸附樹脂；秦艽；環(huán)烯醚萜苷；分離

秦艽（Gentiana macrophylla Pall）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬多年生草本植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥之一，中國藥典2015版收載的秦艽有：秦艽、麻花艽（Gentiana straminea Maxim）、粗莖秦艽（Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk）或小秦艽（Gentiana dahurica Fisch）的干燥根[1，2]。秦艽具有祛風(fēng)濕、止痹痛、清濕熱的功效[3]，其所含的活性成分主要為環(huán)烯醚萜苷類，如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷等[4]。近年來的研究表明，該類成分具有保肝、益肝、抗炎鎮(zhèn)痛等活性[5]。

寧夏六盤山區(qū)所產(chǎn)3種秦艽，均屬于藥典收載的品種[6，7]，本研究采用寧夏六盤山栽培秦艽，在現(xiàn)有秦艽研究的基礎(chǔ)上[8-14]，選定極性、中等極性、非極性共10種大孔吸附樹脂，以龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量為指標(biāo)，用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，采取靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附相結(jié)合的分離富集方式，選定分離富集秦艽環(huán)烯醚萜苷類有效成分的有效大孔吸附樹脂，為充分利用該藥材資源提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日立L-2000高效液相色譜儀（日本）；TYS-400A型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；EL204萬分之一電子天平，（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；增力電動攪拌器（天津市大港區(qū)紅杉實驗設(shè)備廠）。

1.2 試藥

秦艽藥材購自寧夏六盤山藥材種植有限公司，經(jīng)張守宗農(nóng)藝師鑒定為龍膽科植物秦艽，自然晾干，粉碎過藥典二號篩，備用。

大孔樹脂 XDA-1、NKA-9、D301、HPD-100、D1400、D101、D101-1、AB-8、DA-201、DM130（均購自鄭州和成新材料科技有限公司）。

對照品：龍膽苦苷、獐牙菜苦苷均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110770-201515、110785-201404。

食用酒精；甲酸（分析純，西安化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈都為色譜純，進(jìn)口；水為蒸餾水和高純水。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

圖2 龍膽苦苷對照品HPLC圖

圖3 混合樣品的HPLC圖

色譜柱：C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈：0.01%甲酸［10∶90（0 min～10 min）；6∶94（10 min～25 min）；25∶75（25 min～36 min）］；紫外檢測波長：247 nm；流動相流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，經(jīng)實驗表明，在上述流動相和波長下出現(xiàn)的峰最明顯。對照品及樣品色譜圖（見圖1～圖3）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品母液，用甲醇定容配制成 濃 度 為 0.076 mg/mL、0.190 mg/mL、0.266 mg/mL、0.380 mg/mL、0.456 mg/mL 的溶液，然后分別在“2.1”項色譜條件下依次進(jìn)樣，得回歸方程：Y=14 766X+23 911，R2=999，表明龍膽苦苷在0.076 mg/mL～0.456 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

同法得到獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=12 213X-24 995，R2=999，結(jié)果表明獐牙菜苦苷在0.017 3 mg/mL～0.103 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 樣品溶液制備[15]

稱取秦艽藥材適量，用藥材10倍量的65%乙醇動態(tài)熱回流提取30 min，過濾并在60℃下減壓回收乙醇，然后用蒸餾水定容使每毫升藥液相當(dāng)于生藥0.05 g作為藥液備用。

2.4 樣品測定

樣品溶液過直徑為0.45 μm的微孔濾膜，按“2.1”項色譜條件測定，以外標(biāo)法計算樣品中環(huán)烯醚萜苷的含量。

2.5 大孔樹脂的預(yù)處理

稱 取 XDA-1、NKA-9、D301、HPD-100、D1400、D101、D101-1、AB-8、DA-201、DM130 共 10 種樹脂各20 g，分別放入具塞的100 mL三角瓶中，加入95%的乙醇在室溫條件下浸泡24 h，然后裝入色譜柱用95%以上的乙醇以2 BV/h的流速過柱，使流出液與水按1∶5混合不渾濁，然后用蒸餾水洗至洗出液無乙醇味，備用。

2.6 靜態(tài)優(yōu)選大孔吸附樹脂[16，17]

2.6.1 靜態(tài)吸附能力的考察 將預(yù)處理好的10種樹脂各量取10 mL于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入“2.3”項的提取液100 mL，靜置8 h，期間每隔30 min振搖1次，取上清液稀釋10倍，按“2.4”項要求進(jìn)行含量測定。經(jīng)計算結(jié)果（見表1）。

從表1可知，10種大孔樹脂在靜態(tài)吸附中對秦艽環(huán)烯醚萜苷類均有一定量的吸附，但吸附比卻有一定的差異，其中 HPD-100、XDA-1、D301、AB-8、D101-1吸附比較高，而其余5種樹脂的吸附比較低，因此，選取吸附量較高的5種樹脂進(jìn)行靜態(tài)洗脫率的考察。

2.6.2 靜態(tài)解吸能力的考察 將“2.6.1”項篩選出的吸附量較高的樹脂過濾，分別用250 mL蒸餾水洗去樹脂表面的殘留物及環(huán)烯醚萜類，然后分別依次用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇各100 mL進(jìn)行洗脫，每種濃度乙醇用搖床振搖16 h，使其完全達(dá)到洗脫平衡，過濾，再加入另一種濃度乙醇，回收各解吸濃度乙醇溶劑,干燥并稱重，甲醇定容至適宜濃度，按“2.4”項要求進(jìn)行含量測定，并根據(jù)固形物的量計算環(huán)烯醚萜苷類在固形物中的含量。經(jīng)計算結(jié)果（見表2）。

由表2知，5種樹脂在用不同濃度乙醇解吸過程中，10%、30%、50%三個濃度梯度洗脫較集中，其中XDA-1、HPD-100、D301、D101-1 這 4 種樹脂的總體洗脫率較高，而AB-8的被解吸率較低，因此，動態(tài)實驗篩選過程中采用 XDA-1、HPD-100、D301、D101-1 4種樹脂進(jìn)行，同時，洗脫劑濃度以10%、30%、50%、70%的乙醇濃度進(jìn)行。

2.7 動態(tài)優(yōu)選大孔吸附樹脂[18-20]

2.7.1 動態(tài)吸附能力的考察 根據(jù)靜態(tài)所選取的樹脂，取處理好的樹脂各10 mL于選定的色譜柱中，用“2.3”項上樣液以4 BV/h的流速上樣，薄層層析法進(jìn)行檢測（乙酸乙酯-甲醇-水；20∶2∶1 為展開劑，紫外下顯色）流出液中環(huán)烯醚萜苷類以龍膽苦苷計，當(dāng)流出液中龍膽苦苷與上樣液相當(dāng)，說明樹脂已飽和，然后用蒸餾水洗脫至流出液做Molish反應(yīng)為陰性，收集上樣流出母液和蒸餾水洗脫液（量取出總體積），按“2.4”項要求測定其中未被樹脂吸附的環(huán)烯醚萜含量，結(jié)果（見表3）。由表3可知，4種樹脂動態(tài)吸附量均高于靜態(tài)吸附量，其中XDA-1的吸附比為35.385 mg/mL，D101-1的吸附比為26.801 mg/mL。

表1 10種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附量的考察

表2 5種大孔吸附樹脂靜態(tài)解吸能力的考察

2.7.2 動態(tài)解吸附能力的考察 將“2.7.1”項下，已飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗至流出液Molish反應(yīng)為陰性，然后依次用10%、30%、50%、70%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，薄層層析檢測無龍膽苦苷時，換用下一個梯度，洗脫速度為3 BV/h，分別吸取各梯度洗脫液適量并稀釋至適宜濃度，按“2.4”項要求進(jìn)行含量測定。結(jié)果（見表4）。由表4可知，4種樹脂在用不同濃度乙醇動態(tài)解吸過程中10%、30%兩個濃度梯度洗脫較集中，其中樹脂XDA-1的總體洗脫率較高，其洗脫率為97.20%，洗出固形物的量也以樹脂XDA-1為最高，達(dá)到455.597 mg，環(huán)烯醚萜苷類在固形物中的含量為75.48%。

表3 4種大孔吸附樹脂動態(tài)吸附量的考察

表4 4種大孔吸附樹脂動態(tài)解吸能力的考察

3討論

本實驗選取10種不同極性的大孔吸附樹脂，進(jìn)行靜態(tài)吸附與解吸、動態(tài)吸附與解吸方法，最終優(yōu)選出了分離富集秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分較好的大孔吸附樹脂為XDA-1，對于XDA-1分離富集秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分的具體工藝條件，本課題組正在進(jìn)行研究中。

本實驗在用動態(tài)乙醇梯度洗脫過程中，發(fā)現(xiàn)XDA-1的10%、30%乙醇洗脫液濃縮后都有白色針狀結(jié)晶析出，D301的10%乙醇洗脫液和D101-1的30%乙醇洗脫液濃縮后也有白色針狀結(jié)晶析出，經(jīng)薄層色譜鑒定該結(jié)晶物均為龍膽苦苷，這對于分離純化秦艽龍膽苦苷純品提供了有利的條件。

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Effects of different macroporous adsorption resin on the separation and enrichment of erythritolide elements from Gentiana macrophylla pall

HAO Caiqin，CHEN Haiyan，GUO Chao，XU Chao
（Ningxia Professional Technology Institute，Yinchuan Ningxia 750002，China）

Objective is to optimization macroporous adsorption resin with strong adsorption and desorption for the Gentiana iridoid glycosides from 10 kinds of macroporous adsorption resins with different polarities.Static and dynamic adsorption-desorption were used to select the best separation and purification macroporous resin,with the content of gentiopicroside and swertanin as index.XDA-1 type resin showed the best separation and purification.Its separation and purification results were as follows∶the adsorption ratio of iridoid glycosides was 35.385 mg/mL,the elution rate was 97.20%,wash out the solid content is 455.597 mg,the content of the iridoid glycosides in the solid was 75.48%.Conclusion is that XDA-1 has a good effect on the separation and enrichment of the iridoid glycosides from Gentianamacrophylla pall.

macroporous resin；Gentiana macrophylla pall；iridoid glycosides；separation

O657.7

A

1673-5285（2017）07-0120-06

10.3969/j.issn.1673-5285.2017.07.027

2017－06-08

寧夏回族自治區(qū)教育廳項目，項目編號：NGY2015215；寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏廣播電視大學(xué)項目，項目編號：XJ201624。

郝彩琴，女（1979-），陜西榆林府谷人，副教授，主要從事天然藥物提取分離及分析檢驗方面的研究工作，郵箱：hao0418@126.com。