菠菜葉蛋白泡沫法分離工藝的優化

劉 龍 張 煒 陳元濤 劉海彬 高中超 雷 蕾

(青海師范大學化學系，青海 西寧 810008)

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菠菜葉蛋白泡沫法分離工藝的優化

劉 龍 張 煒 陳元濤 劉海彬 高中超 雷 蕾

(青海師范大學化學系，青海 西寧 810008)

為有效開發利用菠菜葉蛋白資源，以菠菜葉為原料，在單因素試驗基礎上，以回收率和富集比為指標，選取稀釋倍數、氣速、溫度和pH值為考察因素，根據Box-Behnken試驗設計原理進行響應面試驗設計優化得出泡沫法分離菠菜葉蛋白的最佳工藝條件為：稀釋倍數16倍、氣速260 mL/min、溫度40 ℃、pH 7.5，在該條件下，回收率和富集比分別達81.56%、14.94。研究結果表明泡沫分離技術是實現菠菜葉蛋白粗分離的一種有效方法。

菠菜葉；蛋白；泡沫分離；回收率；富集比

葉蛋白是植物葉體內各種氨基酸組成的具有特定空間結構的高分子聚合物[1]，是世界上最大的可再生蛋白質資源之一，營養均衡、不含膽固醇，是優質蛋白的重要來源[2]。

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)原產于伊朗，又稱波斯菜、菠棱菜、赤根菜等，富含多種蛋白質、氨基酸、維生素及鐵、鈣、鎂等多種礦物質，有“菜中之王”“維生素寶庫”之美稱[3-4]。目前，有關菠菜的研究大多都集中于維生素及微量元素，并已研制出菠菜蛋糕、菠菜冰淇淋、菠菜飲料等[5]，而有關菠菜葉蛋白的理論研究卻很少，舒友琴等[6]對菠菜葉蛋白進行了堿液提取，梁麗琴等[7]對菠菜葉蛋白進行了酶解多肽的制備，但未見對其分離純化的報道。據測定，每500 g 菠菜中含蛋白12.5 g，相當于2個雞蛋的含量，比白菜高2倍[8]；與大豆餅蛋白相比較，必需氨基酸的數量和所占比例均優于大豆餅蛋白[9]；由于菠菜中的許多蛋白質與酚類和黃酮類化合物以復合體的形式存在，因此具有較強的抗氧化能力，也是良好的天然抗氧化劑來源[10-11]。另外菠菜種植面積廣、生長周期短、是人類的常食蔬菜之一，因此開發利用菠菜葉蛋白，不僅能緩解蛋白質資源的緊缺，還能減少人們攝入過多動物蛋白造成的危害，對提高人類膳食水平具有重要的現實意義[12-13]。

目前，葉蛋白的主要提取分離方法有直接加熱法、酸(堿)加熱法、鹽析法、有機溶劑法、酸堿沉淀法、發酵酸法和酶法等[14-15]。但在通常的工業規模條件下，一系列的層析、超濾、沉淀等步驟用于蛋白質的分離和濃縮，能耗高、耗時長[16]，且這些方法大多只考慮了蛋白分離的單個因素，削弱了蛋白的分離效果，因此尋找一個綜合有效的菠菜葉蛋白提取分離方法勢在必行[17]。

泡沫分離技術是基于表面活性物質在泡沫上的選擇性物理吸附，從而達到表面活性物質與多組分體系分離、濃縮的技術[16]。它具有能耗低、條件溫和、有機溶劑用量少、易于工業放大、可連續操作等優點，是一種具有廣泛發展前景的分離技術[18-19]。目前，泡沫分離技術不僅被廣泛用于礦物浮選、石油污染廢水處理[20]，還用于生化、蛋白[21-22]、多糖[23]等領域的分離濃縮。將泡沫分離法用于菠菜葉蛋白的分離提取可將幾種常用葉蛋白提取方法的關鍵因素結合在一起，實現分離效果的最大化。

本研究以菠菜為原料，采用泡沫分離技術，通過響應面優化分析稀釋倍數、氣速、溫度和pH值等因素對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響，以確定菠菜葉蛋白的最佳提取工藝參數，旨在為今后菠菜葉蛋白的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜：選購于青海湟源縣草原村韓國大葉菠菜種植基地；

牛血清蛋白標準品(批號：20120202)：上海源葉生物科技有限公司；

考馬斯亮藍G-250(批號：W20J7E9268)：高純，上海源葉生物科技有限公司；

磷酸、無水乙醇：AR級，天津市開通化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

雙光束紫外-可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

玻璃轉子流量計：LZB型，南京順來達測控設備有限公司；

空壓機：FB45/7型，上海捷豹壓縮機制造有限公司；

pH計：PB-10型，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；

分析天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

恒溫水浴鍋：IKA IC型，廣州儀科實驗室技術有限公司；

旋轉蒸發儀：IKARV-10型，廣州儀科實驗室技術有限公司；

循環水恒溫泡沫分離柱(見圖1)：內徑35 mm、外徑 40 mm、柱高800 mm，本實驗室自制。

1. 空壓機 2. 壓力表 3. 閥門 4. 緩沖瓶 5. 轉子流量計 6. 泡沫分離柱 7. 循環水入口 8. 循環水出口 9. 泡沫接收器

圖1 泡沫分離裝置圖

Figure 1 Experimental apparatus for foam fractionation

1.3 方法

1.3.1 菠菜預處理 將采購的新鮮菠菜洗凈后，55 ℃烘干，粉碎過80目篩，備用。

1.3.2 菠菜葉蛋白的提取 按m菠菜∶m水=1∶10的比例，準確稱取過篩后的菠菜葉粉末，在55 ℃條件下，用pH=9.5的氫氧化鈉水溶液磁力攪拌提取0.5 h，重提1次，合并提取液，濾紙抽濾，備用[6]。

1.3.3 菠菜葉蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍比色法[24]。

1.3.4 菠菜葉蛋白泡沫分離的評價指標 分別按式(1)、(2)計算菠菜葉蛋白的回收率和富集比。

(1)

(2)

式中：

R——菠菜葉蛋白回收率，%；

E——菠菜葉蛋白富集比；

C0——菠菜葉蛋白初始液質量濃度，μg/mL；

Cf——菠菜葉蛋白泡沫層質量濃度，μg/mL；

V0——菠菜葉蛋白初始液體積，mL；

Vf——菠菜葉蛋白泡沫層體積，mL。

1.3.5 泡沫分離菠菜葉蛋白單因素試驗

(1) 稀釋倍數對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響：控制裝液量600 mL，氣速300 mL/min，溫度45 ℃，pH 7.0，選取稀釋倍數為30，25，20，15，10，7倍進行泡沫分離，以回收率和富集比為評價指標來確定最佳稀釋倍數。

(2) 溫度對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響：在控制裝液量600 mL，稀釋倍數15，氣速300 mL/min，pH 7.0的條件下，選取溫度為25，30，35，40，45，50 ℃，以回收率和富集比為評價指標來確定最佳溫度。

(3) 氣速對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響：在控制裝液量600 mL，稀釋倍數15，溫度45 ℃，pH 7.0的條件下，選取氣速為200，250，300，350，400，450 mL/min進行泡沫分離，以回收率和富集比為評價指標來確定最佳氣速。

(4) pH對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響：在控制裝液量600 mL，稀釋倍數15倍，氣速300 mL/min，溫度45 ℃，pH 7.0的條件下，選取pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，9.0進行泡沫分離，以回收率和富集比為評價指標來確定最佳pH。

1.3.6 泡沫分離菠菜葉蛋白響應面優化試驗設計 利用軟件Design-Expert 8.0.6，根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選擇 4因素3水平進行響應面試驗設計，即稀釋倍數、溫度、氣速、pH 4個因素為自變量，回收率和富集比為響應值，探究菠菜葉蛋白泡沫分離的最佳工藝條件組合。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 稀釋倍數對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響 由圖2可知，在稀釋倍數為7～30時，隨著稀釋倍數的增大，菠菜葉蛋白回收率從88.3%降低到84.3%，富集比從6.6上升到26.9。因為稀釋倍數減小，吸附在泡沫上的蛋白質雙分子層逐漸趨于飽和[25]，且濃度越高，泡沫上蛋白質分子排列越緊密，起泡性越強，液膜越厚，排液速率越慢，持水量越多。考慮到泡沫分離工藝過程應盡量保證較低的稀釋倍數，選取稀釋15倍作為下一步的研究條件。

圖2 稀釋倍數對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響

2.1.2 氣速對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響 由圖3可知，在氣速為200～450 mL/min時，隨著氣速的增大，泡沫分離菠菜葉蛋白回收率從77.4%增大到86.0%，而富集比從13.8降低到5.8。這是因為氣速增大，單位時間產生的泡沫增多，滯留時間較短，持液量增加[26]。綜合考慮氣速對泡沫分離菠菜葉蛋白回收率和富集比的影響，選取氣速為300 mL/min作為下一步的研究條件。

圖3 氣速對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響

2.1.3 溫度對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響 由圖4可知，在溫度為25～50 ℃時，隨著溫度的升高，菠菜葉蛋白回收率從78.9%降低到71.0%，富集比從8.6上升到14.2。這是因為溫度升高，泡沫黏度降低，穩定性變差，聚并加劇，排液速率加快[27]。此外，研究還發現升高溫度能顯著提高泡沫分離菠菜葉蛋白的時間效率(35 ℃約為30 min，45 ℃僅需15 min)。綜合考慮，選取45 ℃作為下一步的研究條件。

2.1.4 pH對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響 由圖5可知，在pH為5.5～9.0時，隨著pH的增大，菠菜葉蛋白的回收率先升高后降低，pH=7.0時最高(74.7%)，富集比先降低后升高，pH=6.5時最低(9.1)。這是因為pH較低時(<7.0)，隨pH升高，菠菜葉蛋白的溶解度增加，起泡性變好[28]，回收率升高，持液量增加，富集比降低；pH較高時(>7.0)，溶解度的增加對菠菜葉蛋白起泡性的影響不再顯著，而是隨著pH值的增大，分子間靜電荷增加，分子間排斥力增大，泡沫聚并現象加重，總體泡沫吸附量降低，單位泡沫吸附量增加。考慮到泡沫分離應在保證一定回收率的前提下來提高富集比，且中性對工業設備損害較小，選取pH 7.0 作為下一步的研究條件。

圖4 溫度對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響

圖5 pH對泡沫分離菠菜葉蛋白的影響

2.2 響應曲面法優化泡沫分離菠菜葉蛋白工藝試驗結果及分析

2.2.1 菠菜葉蛋白響應面因素水平設計表 根據單因素試驗結果確定的因素水平表見表1。

表1 菠菜葉蛋白響應面因素水平設計表

2.2.2 響應面試驗結果 響應面試驗設計及試驗結果見表2。對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到泡沫分離菠菜葉蛋白回收率(R)和富集比(E)的擬合方程：

R=80.90-4.37A+1.59B-4.93C+0.16D-0.45AB-0.58AC+0.41AD+0.17BC-2.41BD-2.36CD-3.45A2-2.83B2+0.17C2-3.19D2,

(3)

E=7.39+3.31A-2.05B+0.61C+0.89D-1.28AB+0.16AC+0.82AD-0.69BC-0.21BD-0.28CD-0.019A2+0.96B2-0.22C2+2.04D2。

(4)

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回收率線性回歸分析表?

表4 富集比線性回歸分析表?

2.2.4 3D響應面分析 由圖6可知，回收率隨著氣速的增加而增大(a，d，e)，隨著稀釋倍數、溫度的升高而減小(a，b，c，d，f)，隨著pH的升高先升高后降低(或趨于平緩)(c，e，f)。兩因素交互作用由大到小為：BD>CD>AC>AB>AD>BC，和方差分析的結論一致。

由圖7可知，富集比隨著稀釋倍數的降低、氣速的增大而減小(a，b，c，d，e)，隨著溫度的升高而增大(b，d，f)，隨著pH的升高先減小后增大(c，e，f)。兩因素交互作用由大到小為：AB>AD>CD>BD>AC>BC，和方差分析的結論一致。

2.3 最佳工藝條件的確定及驗證

2.3.1 最佳工藝條件的確定 模型(3)得出的最佳組合為：稀釋倍數13.50，氣速325.00 mL/min、溫度40.39 ℃、pH 7.02，最佳回收率為86.54%(富集比為5.17)；模型(4)得出的最佳組合為：稀釋倍數19.91、氣速264.82 mL/min、溫度47.14 ℃、pH 7.41，最佳富集比為16.50(回收率為67.56%)，可以看出2個指標是相反的過程(與單因素試驗結果一致)。基于回收率和富集比是泡沫分離的2個重要指標，缺一不可，且一般應在保證一定回收率的條件下來提高富集比。因此，調整確定最佳優化工藝條件為：稀釋倍數15.99，氣速259.48 mL/min，溫度40.00 ℃，pH 7.50，理論回收率83.55%，理論富集比13.17，可信度達0.926，模型擬合度較高。

圖6 回收率響應面3D圖

圖7 富集比響應面3D圖

2.3.2 驗證實驗 為了驗證建立模型的可靠性，利用響應面軟件所給的最優工藝條件并結合實際操作，選取稀釋倍數16、氣速260 mL/min、溫度40 ℃、pH 7.5進行實驗驗證，重復3次。在此條件下，驗證結果為：回收率81.56%，富集比14.94，均與預測值接近。說明采用響應面法得到的擬合模型能很好地預測回收率和富集比與各試驗因素之間的關系，工藝參數可靠，具有一定的實際應用價值。

3 結論

(1) 本研究在單因素試驗基礎上，以回收率和富集比為指標，根據Box-Behnken試驗設計原理，對泡沫法分離菠菜葉蛋白進行響應面工藝優化驗證，得出最佳工藝條件為：稀釋倍數16，氣速260 mL/min，溫度40 ℃，pH 7.5，在此條件下，回收率81.56%，富集比14.94。試驗結果表明，泡沫分離技術是一種實現菠菜葉蛋白粗分離的有效，低成本方法，為菠菜葉蛋白的開發利用提供了理論依據和試驗參考。

(2) 本研究證實了泡沫法分離菠菜葉蛋白的可行性，拓展了泡沫分離技術在分離提取葉蛋白領域的應用。

(3) 然而，目前泡沫分離技術大多適用于低濃度，具有表面活性物質的分離提取，有關菠菜葉蛋白功能性質的改善及高濃度下的泡沫分離提取有待進一步研究。

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Optimization on foam separation process for spinach leaf protein

LIU Long ZHANG Wei CHEN Yuan-tao LIU Hai-bin GAO Zhong-chao LEI Lei

(Department of Chemistry, Qinghai Normal University, Xining, Qinghai 810008, China)

In order to develop and utilize spinach leaf protein resources effectively, the spinach leaves were used as raw material in this work. Based on the single factor experiments, Box-Behnken design was adopted to investigate the influence of four factors: the dilution ratio, gas velocity, temperature and pH on recovery rate and enrichment ratio of leaf protein from spinach leaves. The optimum conditions for the foam separation of spinach leaf protein were found: diluting time of 16 times, gas velocity of 260 mL/min, temperature of 40 ℃, pH value of 7.5. Under these conditions, the recovery and enrichment ratio reached to 81.56% and 14.94, respectively. The results show that foam separation technique is an effective method to separate leaf protein from spinach.

spinach leaf; protein; foam separation; recovery; enrichment ratio

青海省基礎研究計劃項目(編號：2017-ZJ-712)

劉龍，男，青海師范大學在讀碩士研究生。

張煒(1972—)，女，青海師范大學教授，碩士。 E-mail：zhangwei@qhnu.edu.cn

2017—03—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.034