α-硫辛酸對血糖波動狀態下2型糖尿病大鼠血管內皮細胞功能及PI3K/Akt/GSK-3β通路的影響

王景尚，孫明月，黃 燁，殷惠軍

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·論著·

α-硫辛酸對血糖波動狀態下2型糖尿病大鼠血管內皮細胞功能及PI3K/Akt/GSK-3β通路的影響

王景尚1，孫明月2，黃 燁3*，殷惠軍4

目的 觀察α-硫辛酸(α-LA)對血糖波動狀態下2型糖尿病(T2DM)大鼠血管內皮細胞功能及磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合酶激酶3β(GSK-3β)通路的影響，初步探討其作用機制。方法 2013年7—12月，選取50只清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，采用普通飼料適應性喂養2周后，采用隨機數字表法抽取10只作為正常組(NOR組)，余下40只大鼠建造T2DM模型，給予高脂飼料6周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，然后給予普通飼料2周，并于第10周連續尾靜脈采血檢測空腹血糖(FBG)，計算空腹血糖變異系數(FBG-CV)，以FBG>16.7 mmol/L視為造模成功，共造模成功T2DM大鼠36只；NOR組始終給予普通飼料，并在相同時間點一次性腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，且運用相同方法檢測7次FBG，并計算FBG-CV。將造模成功的T2DM大鼠，以FBG-CV>2倍NOR組FBG-CV為波動高糖組(BHG組，24只，選取FBG-CV較大的20只進行實驗)，以NOR組FBG-CV

糖尿病,2型；硫辛酸；血糖；內皮細胞；磷酸肌醇3-激酶；蛋白激酶類；糖原合成酶激酶類

王景尚,孫明月,黃燁,等.α-硫辛酸對血糖波動狀態下2型糖尿病大鼠血管內皮細胞功能及PI3K/Akt/GSK-3β通路的影響[J].中國全科醫學，2017，20(24):2965-2971.[www.chinagp.net]

WANG J S,SUN M Y,HUANG Y,et al.Effects of α-lipoic acid on the vascular endothelial cell function and PI3K/Akt/GSK-3β pathway in rats with type 2 diabetes mellitus and high blood glucose fluctuation[J].Chinese General Practice，2017，20(24):2965-2971.

近年來，隨著臨床流行病學研究進展，血糖波動對于糖尿病患者的危害越來越受到重視，其在糖尿病血管并發癥發生發展中的作用以及如何進行有效的預防及治療成為糖尿病防治領域的研究熱點之一[1]。氧化應激被認為是糖尿病血管并發癥發生發展的統一病理機制，抗氧化治療也被認為是防治糖尿病并發癥的重要手段之一[2]。α-硫辛酸(α-LA)是一種很好的天然抗氧化劑，目前已被應用于糖尿病并發癥，特別是糖尿病周圍神經病變的防治中，臨床療效也得到證實[3]。但α-LA對于血糖波動條件下的糖尿病血管病變及氧化應激的保護效應及可能的作用機制，目前尚缺乏相關研究。本研究通過高脂飲食聯合低劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，并根據大鼠空腹血糖變異系數(FBG-CV)將其分為波動高糖組(BHG組)和穩定高糖組(SHG組)，運用α-LA進行干預，觀察α-LA對血糖波動大鼠血管內皮細胞功能及磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合酶激酶3β(GSK-3β)通路的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 α-LA(批號：129K0218，用蒸餾水配制成所需濃度混懸液)、STZ(批號：040M1357)均購自美國Sigma-Aldrich公司；空腹血漿胰島素(FINS)放射免疫試劑盒購自中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所；大鼠肝細胞生長因子(HGF)、糖基化終末產物(AGEs)定量ELISA試劑盒均為R&D公司進口分裝產品；一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗Akt(批號：4691S)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)(批號：9271S)、GSK-3β(批號：9315)、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)(批號：9336S)兔多克隆抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(批號：ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；動物飼料購自軍事醫學科學院實驗動物中心，其中高脂飼料含10%脂肪、10%蔗糖、2.5%膽固醇、0.25%膽酸鹽。

1.2 動物分組及模型制備 2013年7—12月，選取50只清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠﹝購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2006-0008，體質量180～220 g，室溫保持在(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照時間7:00～19:00﹞，采用普通飼料適應性喂養2周后，采用隨機數字表法抽取10只作為正常組(NOR組)，余下40只大鼠建造T2DM模型，給予高脂飼料6周后，一次性腹腔注射STZ(檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液配制，pH值為4.4)35 mg/kg，然后給予普通飼料2周，并于第10周連續尾靜脈采血檢測空腹血糖(FBG)(7次)，計算FBG-CV(FBG-CV=日間血糖平均數/日間血糖標準差)，以FBG>16.7 mmol/L視為造模成功，共造模成功

本研究主要內容：

目前，我國已成為全球糖尿病第一大國。有效控制血糖、預防血管并發癥的發生是糖尿病治療的關鍵。現階段，人們對于降糖本身的重視程度遠大于對血糖波動的關注，而近來研究顯示，血糖波動可能具有更大的危害性，這與其能夠誘發更嚴重的氧化應激損傷密切相關。抗氧化治療被認為是防治糖尿病并發癥的重要手段之一。α-硫辛酸是一種天然抗氧化劑，目前已被應用于糖尿病周圍神經病變的防治中，臨床療效也得到證實，但其對于血糖波動狀態下血管病變的保護效應及機制仍有待闡明，相關體內實驗仍欠缺。基于此，本研究通過構建2型糖尿病大鼠血糖波動體內實驗模型，初步證實了α-硫辛酸對血糖波動狀態下2型糖尿病大鼠血管內皮細胞功能具有明顯保護效應，且該保護效應與其能夠顯著抗氧化應激及調控磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合酶激酶3β(GSK-3β)通路蛋白磷酸化表達密切相關，將為其臨床應用提供一定實驗依據。

T2DM大鼠36只；NOR組始終給予普通飼料，并在相同時間點一次性腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，且運用相同方法檢測7次FBG，并計算FBG-CV。將造模成功的T2DM大鼠，以FBG-CV>2倍NOR組FBG-CV為BHG組(24只，選取FBG-CV較大的20只進行實驗)，以NOR組FBG-CV

1.3 FBG、FINS水平檢測 采用中國中醫科學院西苑醫院檢驗科HI-TACH717全自動生化分析儀測定FBG。采用放射免疫法檢測FINS水平，具體操作嚴格按照放射免疫試劑盒說明書要求，由北京萊博特利生物醫學科技有限公司檢測。

1.4 血管內皮細胞損傷指標(HGF、NO)、氧化應激指標(SOD、MDA、AGEs)水平檢測 取大鼠腹主動脈血漿，采用ELISA法檢測HGF、AGEs水平，具體操作均嚴格按照試劑盒說明書進行；取大鼠腹主動脈血清，分別采用硝酸還原酶法檢測NO水平、鄰苯三酚自氧化法檢測SOD活性、硫代巴比妥酸(TBA)比色法檢測MDA水平。

1.5 PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白(Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β)水平及Akt、GSK-3β激活程度(p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β)檢測 采用Western blotting法檢測主動脈Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β水平。將主動脈組織從液氮中取出，快速研磨，提取總蛋白，應用Bradford法測定蛋白含量；進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；用5% TBST脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min；TBST漂洗液洗膜10 min×3次；加入用適當漂洗液稀釋的抗體(Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β均為1∶1 000)，封口，4 ℃孵育過夜；用大量TBST漂洗液洗膜10 min×3次；加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β均為1∶2 000)，37 ℃振蕩60 min；TBST漂洗液洗膜10 min×3次，吸水紙吸干，應用顯影定影法顯像，保存掃描，用IPP軟件分析目的蛋白水平，計算p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、FBG水平、FINS水平比較 4組大鼠體質量、FBG水平、FINS水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；SHG組、FHG組大鼠體質量、FINS水平低于NOR組，FBG水平高于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05)；α-LA組大鼠體質量低于NOR組，FBG水平高于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05)；α-LA組大鼠FBG水平低于FHG組，FINS水平高于FHG組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 各組大鼠HGF、NO、SOD、MDA、AGEs水平比較 4組大鼠HGF、NO、SOD、MDA、AGEs水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；SHG組、FHG組大鼠HGF、NO、MDA、AGEs水平高于NOR組，SOD水平低于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05)；SHG組、α-LA組大鼠HGF、NO、MDA、AGEs水平低于FHG組，SOD水平高于FHG組，差異有統計學意義(P<0.05)；α-LA組大鼠SOD水平低于NOR組，MDA水平高于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。2.3 各組大鼠Akt水平、p-Akt水平、GSK-3β水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比較 4組大鼠Akt水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；4組大鼠p-Akt水平、GSK-3β水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比較，差異有統計學意義(P<0.05)。SHG組、FHG組大鼠p-Akt水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β低于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05)；α-LA組大鼠p-Akt水平、p-Akt/Akt低于NOR組，GSK-3β水平、p-GSK-3β水平高于NOR組，差異有統計學意義(P<0.05)；SHG組大鼠p-Akt水平、p-Akt/Akt高于FHG組，差異有統計學意義(P<0.05)；α-LA組大鼠p-Akt水平、GSK-3β水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β高于FHG組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table1Comparisonofbodyweight,FBGlevelandFINSlevelinthefourgroups

組別只數體質量(g)FBG(mmol/L)FINS(U/L)NOR組105778±40160±10354±59SHG組103060±401a269±41a245±50aFHG組103082±395a261±25a222±56aα?LA組103282±1091a217±36ab310±41bF值380709115413042P值<0001<0001<0001

注：NOR組=正常組，SHG組=穩定高糖組，FHG組=波動高糖對照組，α-LA組=α-硫辛酸組，FBG=空腹血糖，FINS=空腹血漿胰島素；與NOR組比較，aP<0.05；與FHG組比較，bP<0.05

表2 各組大鼠HGF、NO、SOD、MDA、AGEs水平比較

注：HGF=肝細胞生長因子，NO=一氧化氮，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛，AGEs=糖基化終末產物；與NOR組比較，aP<0.05；與FHG組比較，bP<0.05

表3 各組大鼠Akt水平、p-Akt水平、GSK-3β水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比較

注：Akt=蛋白激酶B，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B，GSK-3β=糖原合酶激酶3β，p-GSK-3β=磷酸化糖原合酶激酶3β；與NOR組比較，aP<0.05；與FHG組比較，bP<0.05

3 討論

有效預防糖尿病患者血管并發癥的發生，是糖尿病治療的重要目標。目前，氧化應激被認為是糖尿病并發癥發生的統一病理機制[4]，由此抗氧化治療也成為糖尿病防治的熱點之一。近年來隨著臨床流行病學的進展，人們對于糖尿病患者血糖波動的認識逐漸加深，血糖波動也被認為是導致糖尿病并發癥及不良事件的獨立危險因素[1]。既往研究證實，血糖波動的顯著增加能夠誘發更為嚴重的機體及細胞內氧化應激[5-6]。本課題組前期體外研究也證實，應用波動性高血糖培養基培養人臍靜脈內皮細胞，可使其MDA、NO、氧化氮合酶(NOS)水平顯著升高，SOD水平顯著降低[7]。因此，在血糖波動狀態下，有效地進行抗氧化應激治療，對于改善血管內皮細胞功能、防治血管并發癥具有更為重要的意義。

本研究結果顯示，SHG組、FHG組大鼠體質量、FINS水平低于NOR組，FBG水平高于NOR組，證明本研究中T2DM大鼠模型制備成功，且具有較好的穩定性，長時期的高血糖可造成模型大鼠體質量顯著下降。SHG組大鼠體質量、FBG水平、FINS水平與FHG組無差異，提示T2DM大鼠高血糖狀態并不等同于血糖波動，血糖波動幅度的增加并不會引起體質量和FINS水平的變化。HGF是由間質細胞產生的多效性生長因子，能刺激多種類型細胞的分化、增殖、運動、遷移，促進新生血管形成，在糖尿病及心血管并發癥的診斷和治療中具有重要作用[8]。血漿HGF作為一種血管內皮細胞損傷的保護性因子，其水平隨著血管內皮細胞損傷程度的加重而逐漸升高，可作為預測血管內皮細胞損傷程度的指標。NO作為內皮依賴性舒張因子，在糖尿病血管病變中起重要作用，通過檢測循環血中NO水平的變化可間接反映血管內皮細胞功能，在病理條件下，產生的大量NO將發揮細胞毒性作用，造成組織細胞損傷[9-10]。本研究結果顯示，SHG組、FHG組大鼠HGF、NO水平高于NOR組，SHG組大鼠HGF、NO水平低于FHG組，進一步證實血糖波動幅度增加加劇了血管內皮細胞損傷和功能障礙。SOD是主要的抗氧化酶之一，能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，阻斷自由基的毒性反應，清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷；MDA是一種脂質過氧化物，脂質過氧化可以造成細胞損傷。因此，檢測二者既能反映機體清除氧自由基的能力，又能反映細胞損傷程度[11]。本研究結果顯示，SHG組、FHG組大鼠SOD水平低于NOR組，MDA水平高于NOR組；SHG組大鼠SOD水平高于FHG組，MDA水平低于FHG組，說明SHG組和FHG組大鼠機體抗氧化和清除自由基能力減弱，造成體內脂質過氧化產物堆積，進而加重對細胞和組織的損傷，而血糖波動幅度增加能加劇機體氧化應激反應，最終加重血管內皮細胞損傷。AGEs是蛋白質的氨基酸、脂質和脂蛋白非酶性糖基化反應的終末產物，研究表明，由持續高血糖所致的AGEs蓄積是引起糖尿病慢性血管并發癥的關鍵因素[12]。體內AGEs的不斷蓄積不僅能促進血管內皮細胞陰離子多糖蛋白的降解，增加血管通透性，破壞血管內皮細胞的屏障作用，還可通過直接滅活NO和誘發氧化應激損傷血管內皮細胞，并通過與血管內皮細胞表面受體結合，刺激多種黏附分子基因表達，從而促進白細胞黏附、聚集及活化，而且還可以刺激血管平滑肌細胞增殖和加快血小板聚集和血栓形成[13-14]，從而在血管性疾病中發揮重要作用。本研究結果顯示，SHG組、FHG組大鼠AGEs水平高于NOR組，SHG組大鼠AGEs水平低于FHG組，說明波動高糖加重T2DM大鼠血管內皮細胞損傷的作用與其加速血漿AGEs的蓄積密切相關。

α-LA具有雙硫鍵，是一種強有力的抗氧化劑，具有很好的清除自由基和活性氧的能力[15]。目前，α-LA已被用于糖尿病周圍神經病變的治療，且取得較好的臨床療效[3]。研究表明，α-LA可通過阻抑神經組織內的氧化應激、增加神經營養血管的血流量、加快神經傳導速度、增加神經Na+-K+-ATP酶活性等機制改善糖尿病周圍神經病變癥狀[16]。近年來，α-LA對于糖尿病血管病變(包括視網膜病變、下肢血管病變、腎臟血管)的防治效應也逐漸得到了重視，其對于氧化應激、血管內皮細胞損傷及血管病變均有一定的療效，但其相關分子機制研究仍欠缺[17]。本研究結果顯示，α-LA組大鼠FBG、HGF、NO、MDA、AGEs水平低于FHG組，FINS、SOD水平高于FHG組，提示α-LA不僅可以降低波動高糖T2DM大鼠的FBG水平、升高FINS水平，還能夠顯著改善波動高糖誘導的血管內皮細胞氧化應激反應，從而發揮保護血管內皮細胞的作用。

目前，對于α-LA防治糖尿病血管并發癥的機制相對缺乏。PI3K/Akt通路是體內重要的細胞通路，在細胞的動員、遷移、分化、抗凋亡及糖代謝過程中均具有重要的作用[18-20]。激活的Akt主要通過促進GSK-3β等下游底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應[21]。既往研究顯示，PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活能夠有效抑制氧化應激、促進增殖、抗凋亡、抑制炎性反應，進而發揮血管內皮細胞保護作用[22-23]。本研究結果顯示，SHG組、FHG組大鼠p-Akt水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β低于NOR組；α-LA組大鼠p-Akt水平、p-Akt/Akt低于NOR組，GSK-3β水平、p-GSK-3β水平高于NOR組；SHG組大鼠p-Akt水平、p-Akt/Akt高于FHG組；α-LA組大鼠p-Akt水平、GSK-3β水平、p-GSK-3β水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β高于FHG組。提示波動高糖狀態可顯著降低T2DM大鼠主動脈p-Akt、p-GSK-3β水平，抑制Akt、GSK-3β激活程度，而α-LA能夠顯著上調血糖波動狀態下T2DM大鼠主動脈PI3K/Akt/GSK-3β通路Akt、GSK-3β磷酸化水平，提高蛋白激活程度，這可能是其改善血糖波動狀態下血管內皮細胞損傷的分子機制之一。但由于條件限制，本研究并未使用PI3K/Akt/GSK-3β通路的抑制劑對其進行阻斷，因此其確切的聯系仍有待進一步的研究證實。

綜上所述，α-LA對血糖波動狀態下T2DM大鼠血管內皮細胞功能具有顯著的保護作用，這與其能夠顯著改善氧化應激、調控PI3K/Akt/GSK3β通路相關蛋白表達密切相關。α-LA在防治糖尿病血管病變中具有較好的應用前景，但需要進一步深入研究。

作者貢獻：王景尚進行實驗設計與實施、統計學處理、撰寫論文并對文章負責；孫明月進行實驗的實施及數據整理；黃燁、殷惠軍進行實驗設計指導及審校。

本文無利益沖突。

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[23]ZENG T,ZHANG C L,SONG F Y,et al.CMZ reversed chronic ethanol-induced disturbance of PPAR-α possibly by suppressing oxidative stress and PGC-1α acetylation,and activating the MAPK and GSK3β pathway[J].PLoS One,2014,9(6):e98658.DOI:10.1371/journal.pone.0098658.

(本文編輯：崔麗紅)

Effects of α-lipoic Acid on the Vascular Endothelial Cell Function and PI3K/Akt/GSK-3β Pathway in Rats with Type 2 Diabetes Mellitus and High Blood Glucose Fluctuation

WANGJing-shang1,SUNMing-yue2,HUANGYe3*,YINHui-jun4

1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,BeijingObstetricsandGynecologyHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100026,China2.GCPCenter,XiyuanHospitalCACMS,Beijing100091,China3.DepartmentofEmergency,XiyuanHospitalCACMS,Beijing100091,China4.SchoolofIntegratedChineseandWesternMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China*Correspondingauthor:HUANGYe,Associatechiefphysician;E-mail:yellow_926@126.com

Objective To explore the effects and mechanism of α-lipoic acid (α-LA) on the vascular endothelial cell function and PI3K/Akt/GSK-3β pathway in rats with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and high blood glucose fluctuation.Methods Fifty male Sprague Dawley (SD) rats of pathogen-free were involved from July to December 2013.All the rats were fed adaptively for 2 weeks with routine diet first.Then 10 rats were chosen as normal group (NOR group) by random number table method.The other 40 rats were fed by high lipid diet for 6 weeks and then were induced by only one intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ,35 mg/kg),then were fed with routine diet for 2 weeks.During the 10th week of intervention,fasting blood glucose (FBG) levels of rats were measured every morning by collecting blood samples from their caudal veins,meanwhile fasting blood glucose coefficient of variation (FBG-CV) were calculated.The rats,of which FBG levels higher than 16.7 mmol/L,were thought to be successful T2DM rats,and here were 36 rats.The NOR rats were induced by only one intraperitoneal injection of citric acid-trisodium citrate buffer solution after 6 weeks of intervention with routine diet,then continued to be fed with routine diet.During the 10th week of intervention,the measurement of their FBG levels was performed as the same as the other rats,and FBG-CV was calculated as well.And then the T2DM rats with higher FBG-CV value (at least 2 times of NOR group) were divided into blowing high blood glucose group (BHG group,24 rats,20 rats with higher FBG-CV were chosen for experiment),the others (NOR group

Diabetes mellitus,type 2;Thioctic acid;Blood glucose;Endothelial cells;Phosphatidylinositol 3-kinase;Protein kinases;Glycogen synthase kinases

國家自然科學基金青年基金資助項目(81202777)；國家自然科學基金面上項目(81573803)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.y32

2017-01-03；

2017-06-07)

1.100026 北京市，首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科

2.100091 北京市，中國中醫科學院西苑醫院GCP中心

3.100091 北京市，中國中醫科學院西苑醫院急診科

4.730000 甘肅省蘭州市，甘肅中醫藥大學中西醫結合學院

*通信作者：黃燁，副主任醫師；E-mail：yellow_926@126.com