2014～2016年廣州市屠宰場分離沙門氏菌血清學鑒定和耐藥性分析

吳荔琴，劉佩怡，伍宏凱，方秋華，肖田安，梁祺琦，何瀅

(廣東省獸藥飼料質量檢驗所，廣州 510230)

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2014～2016年廣州市屠宰場分離沙門氏菌血清學鑒定和耐藥性分析

吳荔琴，劉佩怡，伍宏凱，方秋華，肖田安*，梁祺琦，何瀅

(廣東省獸藥飼料質量檢驗所，廣州 510230)

2014～2016年從廣州市屠宰場分離沙門氏菌151株，鑒定出12種血清型，前3位優勢血清型分別為德爾卑沙門氏菌、羅森氏沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌。采用微量肉湯稀釋法測定分離菌株對13種抗菌藥物的敏感性。結果顯示，沙門氏菌對四環素、多西環素、磺胺異惡唑、氨芐西林、大觀霉素的耐藥率都在60%以上，對奧格門丁、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻呋、多粘菌素E敏感(耐藥率≤16%)，多重耐藥率為79.20%。研究表明，沙門氏菌對部分藥物耐藥性較嚴重，亟需加強養殖業抗菌藥物的合理應用以控制耐藥性的發展。

沙門氏菌；血清型；耐藥性；屠宰場

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌，對人和動物的危害極大。2015年國家食品藥品監督管理總局發布的《食品安全風險解析》，指出沙門氏菌居我國食源性疾病致病菌首位。2006～2010年間我國報告的病因明確的細菌性食源性疾病暴發事件中，70%～80%由沙門氏菌導致。美國食源性疾病主動監測網運用所建立的模型評估認為，美國每年有140萬非傷寒沙門菌病例，導致16.8萬人次就診，1.5萬人次住院和400人死亡。同樣，在歐盟所有病因明確的食源性暴發事件中，由沙門氏菌引起的占比較高。該病原菌對人類健康影響風險較高、造成的經濟損失和社會負擔較大。沙門氏菌在人和動物中具有廣泛的宿主，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑進行傳播。豬是沙門氏菌病原體的主要儲存宿主，在屠宰的時候，豬胴體可能會被腸道中的沙門氏菌污染，從而引起人沙門氏菌感染，對公共衛生構成潛在威脅。隨著中國養豬業的迅速發展和飼養的高度集約化，沙門氏菌已成為危害養豬業的重要細菌性疾病；抗生素的不合理使用導致沙門氏菌產生耐藥性，耐藥范圍逐漸擴大，耐藥程度也在逐漸增加[1-2]。因此,應實時監測畜禽產品中沙門氏菌耐藥趨勢的變化。本文擬調查2014～2016年廣州市生豬屠宰場分離沙門氏菌的血清型及其耐藥情況，以期為有效控制沙門氏菌的感染提供科學依據，保障公共衛生安全。

1 材 料

1.1 樣品來源 2014～2016年從廣州市生豬屠宰場進行每年一次的樣品采集，樣品為豬盲腸拭子，并分離、鑒定沙門氏菌。

1.2 培養基和藥品 沙門氏菌顯色培養基，法國科瑪嘉公司；Amies運送培養基、營養瓊脂、SC增菌液和TTB增菌液，均購自青島海博公司；沙門氏菌核酸檢測試劑盒，中山大學達安基因股份有限公司；藥敏檢測板，天津金章科技發展有限公司；沙門氏菌診斷血清，泰國S&A公司。

1.3 儀器設備 離心機，德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；水浴鍋，華普達教學儀器有限公司；滅菌器，日本Hirayama公司；渦旋振蕩器，德國IKA公司。

1.4 質控菌株 鼠傷寒沙門氏菌CVCC 541，由中國獸醫藥品監察所提供。

2 方 法

2.1 菌株分離 對健康豬屠宰后的盲腸，剪一小口，將無菌拭子插入，粘取盲腸內容物，裝入Amies運送培養基，8 h內分別接種到SC增菌液和TTB增菌液中，分別在36 ℃培養18～24 h和在42 ℃培養22～24 h，用接種環取增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色培養基，將可疑菌落接種另一個沙門氏菌顯色培養基進行純化，將純化的菌落接種于營養瓊脂做進一步鑒定。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 DNA模板的制備 取1 mL無菌水加入2 mL離心管中，用10 μL接種環將可疑沙門氏菌適量挑入離心管中，渦旋震蕩，12000 r/min離心5 min，去除上清液，加入0.5 mL無菌水，渦旋震蕩，沸水浴10 min，冰浴10 min，離心5 min，取上清液作模板。同時陰性菌株和沙門陽性菌株均參與提取，并作為PCR檢測試劑的質控。

2.2.2 PCR-熒光探針法測定 取適量PCR反應管，按照沙門氏菌核酸檢測試劑盒說明書進行操作。

2.3 血清型鑒定 確定的沙門菌屬，用沙門氏菌診斷血清進行分型。按照GB 4789.4-2010操作方法進行。

2.4 藥敏試驗 根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)的標準，用微量肉湯稀釋法測定沙門氏菌的藥物敏感性，結果判定參照CLSI文件標準。操作參照藥敏檢測板說明書；對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)進行判斷和數據讀取。測定藥物共9類13種，包括：氧氟沙星、恩諾沙星、四環素、多西環素、慶大霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、磺胺異惡唑、復方新諾明、氨芐西林、氟苯尼考、奧格門丁、多粘菌素E。同時做質控樣品，質控菌株為鼠傷寒沙門氏菌CVCC 541。

3 結果與分析

3.1 菌落特征 沙門氏菌在顯色培養基上形成淡紫色的圓形菌落。

3.2 PCR鑒定 根據沙門氏菌核酸檢測試劑盒說明書判定，在陰性質控的擴增曲線無明顯對數增長期或Ct值空白，陽性質控的擴增曲線有明顯對數增長期或Ct值≤32的前提下，若樣品的擴增曲線有明顯對數增長期或Ct值≤36，則判樣品為沙門氏菌。共分離沙門氏菌151株，其中2014年65株，2015年49株，2016年37株。

3.3 血清型 分離的151株沙門氏菌除12株不能分型以外，剩下的139株共鑒定出12種血清型。占主導的前5種血清型分別是：德爾卑沙門氏菌(49株，32.45%)、羅森氏沙門氏菌(29株，19.21%)、鼠傷寒沙門氏菌(28株，18.54%)、倫敦沙門氏菌(11株，7.28%)、斯坦利沙門氏菌(9株，5.96%)。每年鑒定出的主導血清型基本一致；但所占比例存在變化，少見或罕見血清型差異較大。2014～2016年沙門氏菌的血清型分布見表1。

表1 2014～2016年沙門氏菌的血清型分布Tab 1 Serotype distribution among Salmonella, 2014～2016

3.4 藥敏結果 對151株沙門氏菌進行了9類13種抗菌藥物的敏感性試驗。從總體上來看，沙門氏菌對四環素(80.13%)、多西環素(77.48%)、磺胺異惡唑(71.52%)、氨芐西林(62.25%)、大觀霉素(60.93%)的耐藥率都在60%以上；其次是復方新諾明(48.34%)、氟苯尼考(37.75%)、慶大霉素(35.10%)的耐藥率在40%左右；對奧格門丁(15.23%)、恩諾沙星(14.57%)、氧氟沙星(9.93%)較低；個別菌株對頭孢噻呋(0.66%)耐藥，無菌株對多粘菌素E耐藥。連續3年耐藥率下降的藥物有氧氟沙星，連續3年耐藥率上升的藥物有慶大霉素、氨芐西林、氟苯尼考。151株沙門氏菌對9類13種抗菌藥物的耐藥性結果見表2。

3.5 多重耐藥 151株沙門氏菌對9類藥物的多重耐藥率(耐藥重數≥3)為79.20%，且有逐年上升的趨勢；最高為7耐(3.97%)。其中，2014年以4耐(18.46%)和6耐(16.92%)為主，2015年以5耐(18.37%)和3耐(16.92%)為主，2016年以5耐(35.90%)和4耐(28.21%)為主。2014～2016年沙門氏菌多重耐藥結果見表3。

表2 2014～2016年沙門氏菌耐藥性情況Tab 2 Antimicrobial resistance among Salmonella, 2014～2016

表3 2014～2016年沙門氏菌多重耐藥情況Tab 3 Multidrug resistance among Salmonella, 2014～2016

4 討論與小結

本次研究分離到的菌株中占主導的前5種血清型分別是：德爾卑沙門氏菌(32.45%)、羅森氏沙門氏菌(19.21%)、鼠傷寒沙門氏菌(18.54%)、倫敦沙門氏菌(7.28%)、斯坦利沙門氏菌(5.96%)。該前3種優勢血清型結果與岳秀英等[2]調查四川省豬源沙門氏菌的主導血清型基本一致，但所占比例存在差異。四川省以德爾卑沙門氏菌為主，所占比例為60.26%；其次是鼠傷寒沙門氏菌(16.56%)和羅森氏沙門氏菌(6.6%)。黃照清[3]等在調查肉品中沙門氏菌血清型時，發現占主導是德爾卑沙門氏菌，比例高達82%。加春生[4]等對哈爾濱地區健康豬場直腸采樣分離沙門氏菌，經鑒定以豬霍亂沙門氏菌(71.4%)為主，其次是豬傷寒沙門氏菌(22.9%)和鼠傷寒沙門氏菌(5.7%)。黃裕[5]等在調查深圳市畜禽產品中沙門氏菌血清型時發現，豬肉中的優勢血清是倫敦沙門氏菌(19.51%)和德爾卑沙門氏菌(14.63%)。說明不同地區占主導的豬源沙門氏菌血清型有所交叉，也存在差異。根據張霆[6]等調查東莞地區引起腹瀉最常見的血清型主要是鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和斯坦利沙門氏菌等。曾健君[7]等在調查惠州市腹瀉患者感染沙門氏菌血清型中發現，引起腹瀉常見的血清型為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。本研究調查屠宰場流行的血清型如鼠傷寒沙門氏菌、斯坦利沙門氏菌等對公共衛生安全存在潛在威脅。

本研究中發現沙門氏菌對四環素、多西環素、磺胺異惡唑、氨芐西林、大觀霉素的耐藥率都在60%以上，其次是復方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率在40%左右，對奧格門丁、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率較低，在9%～16%之間，個別菌株對頭孢噻呋(0.66%)耐藥，無菌株對多粘菌素E耐藥。與四川省豬源沙門氏菌[2]相比，本研究分離的沙門氏菌對多種藥物的耐藥水平顯著較低。黃福標[8]等分離南寧市豬腸道中沙門氏菌，對氨芐西林(55.56%)、慶大霉素(20%)、氧氟沙星(6.67%)的耐藥率較低，但對復方新諾明(80%)的耐藥率較高。不同省份豬源沙門氏菌也呈現出了各自的耐藥特點[9]，與獸醫臨床用藥情況相關。同時，本研究發現，分離菌株對氧氟沙星的耐藥率逐年下降，這可能與農業部2292號公告停止在食品動物中使用氧氟沙星存在相關性；且國家每年實施“氟喹諾酮類藥物殘留監測”計劃，促使養殖場對該類藥物的使用更加規范。但在連續3年監測中發現，對慶大霉素、氨芐西林、氟苯尼考等藥物的耐藥率一直在上升，耐藥水平的上升可能與這三種藥物在獸醫臨床使用廣泛密切相關。

在151株沙門氏菌中有106株菌對3類及3類以上的藥物存在耐藥性，多重耐藥率為79.20%；顯著低于四川省豬源沙門氏菌(94%)[2]；與廣西南寧市豬腸道中沙門氏菌多重耐藥率(80%)[8]一致。但多重耐藥率從2014年的74.62%上升到87.18%。

屠宰場是畜禽產品受沙門氏菌感染的一個重要場所，多重耐藥沙門氏菌可能通過食物鏈傳遞給人類導致抗生素治療的失敗，對公共衛生的風險不可忽視。鑒于本研究的結果，亟需加強養豬業抗菌藥物的合理使用，實時動態監測，有效遏制沙門氏菌耐藥性發展，保障豬肉及豬肉制品的安全，進而保障消費者健康。

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(編輯：侯向輝)

Identification Serotype and Antimicrobial Resistance ofSalmonellafrom the Slaughter Houses in Guangzhou from 2014 to 2016

WU Li-qin，LIU Pei-yi，WU Hong-kai，FANG Qiu-hua，XIAO Tian-an*，LIANG Qi-qi，HE Ying

(GuangdongInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuffsControl,Guangzhou510230,China)

XIAOTian-an，E-mail：xta@gdivdc.com

A total of 151Salmonellastrains were isolated from the slaughter houses in Guangzhou from 2014 to 2016, and 12 serotypes were identified. Among the strains,S.derby,S.rissenandS.typhimuriumwere top 3 serotypes. Antimicrobial susceptibility amongSalmonellaisolates against 13 antimicrobial drugs was performed using microdilution method. The results showed that percents of resistance among the strains were more than 60% for tetracycline, doxycycline, sulfurazole, ampicilin, and spectinomycin, The strains were sensitive to amoxycilin/elavulanic acid, enrofloxacin, ofloxacin, ceftiofur, and polymyxin E (resistance rates were lower than 16% for these drugs). The multidrug-resistance rate was 79.20%. The researches show thatSalmonellastrains were seriously resistant to some drugs. It is urgent that the domestic industry should reasonably use antimicrobials to control the development of antimicrobial resistance.

Salmonella；serotype；antimicrobial resistance；slaughter house

吳荔琴，獸醫師，從事細菌耐藥性和獸藥殘留檢測研究。

肖田安。E-mail：xta@gdivdc.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.04

2017-03-23

A

1002-1280 (2017) 07-0015-06

S852.61