黃芩苷對大鼠口服非索非那定的藥動學影響

王斌，楊銳 ，李思聰，張敏，李金良，李旭廷*

(1.四川省畜牧科學研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066)

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黃芩苷對大鼠口服非索非那定的藥動學影響

王斌1,2，楊銳1,2，李思聰1,2，張敏1,2，李金良1,2，李旭廷1,2*

(1.四川省畜牧科學研究院獸藥研究所，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066)

為了研究黃芩苷對大鼠口服非索非那定藥動學及P-糖蛋白(P-gp)表達的影響，將SD大鼠36只隨機分為A、B、C三組，連續灌胃7 d，A組給予黃芩苷200 mg/kg，B組蒸餾水空白對照，C組維拉帕米藥物對照(10 mg/kg)，第8天灌胃后2 h，各組隨機取6只大鼠處死，解剖并迅速取出肝臟、空腸，熒光定量PCR測定各組織P-gp的mRNA表達水平。各組另外6只大鼠灌胃后同時給予非索非那定(30 mg/kg)，按時間點連續采集血樣，采用高效液相色譜法測定非索非那定血藥濃度。結果表明，黃芩苷對非索非那定的吸收有明顯促進作用，主要表現在黃芩苷組非索非那定峰濃度(Cmax)比空白對照組顯著增加17.04%(P<0.05)，曲線下面積AUC(0-12)顯著增加19.23%(P<0.05)，黃芩苷減少了大鼠空腸和肝臟P-gp的表達(P<0.05)。結論：黃芩苷能下調大鼠P-gp表達，增加P-gp底物非索非那定在大鼠體內的生物利用度，是一種P-gp抑制劑。

黃芩苷；非索非那定；藥動學；熒光定量；P-糖蛋白

黃芩苷是黃芩中主要活性成分，屬于黃酮類化合物，具有抗病毒、抗炎、免疫調節等作用[1-2]。黃芩苷與多種藥物存在相互作用，其與化學藥的相互作用問題越來越受到重視[3-5]。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由1280個氨基酸組成的跨膜蛋白，在藥物吸收、分布、代謝及排泄方面有重要的作用[6]。含有黃芩及黃芩苷的中藥制劑在獸醫臨床應用非常廣泛，研究黃芩苷對藥物轉運蛋白P-gp的影響對指導臨床合理用藥具有重要意義。本研究以非索非那定藥動學參數作為體內P-gp活性的探針，通過觀察黃芩苷對非索非那定大鼠體內藥動學及肝臟和空腸P-gp表達的影響來探討黃芩苷對P-gp活性的影響，為臨床黃芩苷的藥物配伍使用提供科學依據。

1 材 料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司；WH-3微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠；Eppendorf MiniSpin plus離心機，德國Eppendorf 公司；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司。H6-1微型電泳槽，上海精益有機玻璃制品儀器廠；凝膠成像系統，北京君意；T6紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；PCR反應擴增儀，BIO公司； StepOne型熒光定量PCR儀，ABI。

1.2 試劑與藥品 非索非那定對照品(批號：100852-201202)，非那西丁對照品(批號：100095-201205)，維拉帕米對照品(批號：100223-200102)，黃芩苷對照品(批號：110842-201207)，對照品購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜級，其它試劑為分析純。Trizol提取試劑盒，4S Red Plus核酸染色劑，第一鏈cDNA合成試劑盒，上海生工生物工程有限公司。

1.3 試驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠，體重(200±20) g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(川)2013-24。整個試驗期間，于室溫20 ℃～24 ℃下飼養，每天供給飼料及純化水，采血前12 h限飼。

2 方 法

2.1 試驗分組 體重相近雄性大鼠36 只，隨機分為3 組，每組12 只。灌胃給藥，A組黃芩苷200 mg/kg；B組灌注相同體積的蒸餾水，C組灌注維拉帕米10 mg/kg，每日1次，所有受試大鼠連續灌胃7 d，12 h禁食后，第8天，各組隨機挑選6只大鼠，灌藥后2 h斷頸處死，解剖并迅速取出肝臟、空腸，樣品置液氮凍存待檢。各組另外6只灌胃后，立即口服非索非那定30 mg/kg，分別于服藥后0、0.083、0.25、0.5、0.75、l、1.5、2、3、4、6、8、12 h斷尾采血，3000 r/min離心和分離血漿，-20 ℃保存備用。

2.2 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL，加入等體積的乙腈，渦旋3 min，12000轉離心5 min，取上清液置于另一離心管中，氮吹儀吹干，用流動相100 μL溶解，渦旋1 min，取20 μL進樣。

2.3 液相色譜法測定非索非那定血藥濃度 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶0.5%磷酸二氫鉀(pH3.8)：三乙胺(30∶70∶0.3)；流速：1.0 mL·min-1；UV檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，非索非那定與非那西丁、溶劑峰、血漿及其他組分能完全分開，該方法血漿的定量限為0.054 μg/mL。

血漿樣品標準曲線范圍在0.054～21 μg/mL之間，線性關系良好。在標準曲線范圍內，回收率為99.7%～101.4%，批內變異系數和批間變異系數分別為2.67%～5.64%和3.12～4.85%。

2.4 熒光定量PCR檢測大鼠肝、空腸P-gp表達 用于UNIQ-10 柱式 Trizol 總RNA抽提試劑盒提取各組樣品RNA，按常規方法進行反轉錄，反應體系為25 μL，反轉錄產物-20 ℃保存備用。將cDNA樣品稀釋8倍作為模板上機檢測，最終擴增反應按95 ℃預變性3 min，95 ℃變性7 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共45循環。所有樣品檢測均含有一個平行樣本，并包含1個無模板的陰性對照以排除假陽性結果，以GAPDH 管家基因作為內標，對基因P-gp的mRNA表達進行相對定量分析，將所得Ct按照2-(△△Ct)方法進行計算分析統計結果。

表1 實時熒光定量RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of real time fluorescent quantitative RT-PCR

2.5 數據分析 采用藥動學分析軟件DAS3.0，以非房室模型處理血漿濃度-時間數據，獲得藥動學參數，數據以平均數±標準差(x±s)表示，組間數據采用SPSS11.0統計軟件進行t 檢驗。

3 結 果

3.1 藥物動力學結果 各組大鼠體內的非索非那定血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥物動力學參數結果見表2。結果表明，黃芩苷和維拉帕米誘導后，與對照組相比，非索非那定血藥濃度-時間曲線下面積AUC(0-12)顯著增加(P<0.05)，達峰濃度(Cmax)顯著升高(P<0.05)，達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、平均駐留時間MRT(0-12)、清除率(CLZ/F)各組差異不顯著。

3.2 大鼠肝、空腸P-gp蛋白mRNA的表達 熒光定量RT-PCR檢測結果見圖2，維拉帕米和黃芩苷誘導對大鼠肝、腸的P-gp mRNA表達量有下調作用(P<0.05)，且維拉帕米的下調程度大于黃芩苷。

圖1 各組灌胃后非索非那定的血藥濃度-時間曲線 Fig 1 Plasma concertration-time curves of fexofenadine in the different groups(x±s，n=6)

參數ParametersA組AgroupB組BgroupC組CgroupCmax/(mg﹒L-1)7.190±1.182*6.143±0.7818.202±0.841*Tmax/h1.503±0.7861.526±0.1471.482±0.214AUC(0-12)/(mg·L-1·h)19.608±2.556*16.445±2.67720.468±2.452*t1/2/h2.343±0.4162.134±0.2052.148±0.337MRT(0-12)/h2.718±0.4682.903±0.3322.540±0.275CLZ/F/(L·h-1·kg-1)1.521±0.2031.495±0.1681.593±0.281

*0.05水平上差異顯著

*Significant difference at 0.05 levels

* 0.05水平上差異顯著* Significant difference at 0.05 levels圖2 各試驗組大鼠肝、空腸P-gp mRNA表達水平(x±s，n=6)Fig 2 expression level of P-gp mRNA in the live and jejunum of different group (x±s，n=6)

4 討 論

黃芩苷為中藥黃芩的主要活性成分之一，以黃芩提取物入藥的制劑在獸醫臨床應用廣泛，如雙黃連注射液、銀黃注射液、清開靈注射液等，且多以中西藥配伍使用[7]，聯合使用的藥物大多具有藥效的協同作用，同時也可能有相似代謝或轉運途徑，表現為藥動學特征的改變，P-gp介導的相互作用最為常見。基于P-gp抑制機制的相互作用往往會使其底物的療效增加，生物利用度提高，因此，對P-gp抑制劑藥物的研究，在指導臨床聯合用藥及解決多藥耐藥問題都具有重要意義。

Tsuruo等[8]證實維拉帕米對P-gp有抑制作用，可阻礙藥物外排，提高細胞內藥物濃度，改善治療藥物的體內生物利用度，而非索非那定是藥物轉運體P-gp 和有機陰離子轉運體的底物，由于它在體內不被代謝，常用來作為體內評價P-gp 轉運行為的探針藥物[9]。本研究以維拉帕米作為陽性對照藥物，以非索非那定作為體內P-gp的探針藥物，通過觀察黃芩苷對非索非那定藥動學的影響，探討黃芩苷對P-gp的影響。結果顯示，維拉帕米對非索非那定主要藥動學參數影響明顯，Cmax和AUC(0-12)較空白組顯著增加，表明維拉帕米提高了非索非那定在大鼠體內的生物利用度，呈現出P-gp抑制劑的特性。黃芩苷對非索非那定的藥動學參數的改變趨勢與維拉帕米一致，提示黃芩苷可能也是P-gp抑制劑。韋靈玉等[10]將黃芩提取液大鼠連續灌胃一周，體外評價P-gp底物羅丹明123和非P-gp底物熒光素鈉經大鼠空腸黏膜吸收方向和分泌方向的轉運變化，發現黃芩提取液對P-gp活性具有抑制作用。范嵐[11]研究了黃芩苷對P-gp底物他林洛爾藥代動力學影響，表明黃芩苷能顯著提高他林洛爾Cmax和AUC(0-12)，顯示黃芩苷可以抑制P-gp活性，與本研究結果一致。 除探針藥物外，利用熒光定量PCR開展藥物轉運體、代謝酶的mRNA表達也是研究藥物-藥物影響和藥物代謝的重要方法。Miao Q等[12]利用Caco-2細胞比較了黃芩素和黃芩苷對的P-gp活性和表達水平的影響，發現黃芩素對P-gp活性和表達水平抑制作用明顯，而黃芩苷對P-gp的表達無影響。本研究選擇大鼠進行體內試驗，熒光定量PCR檢測誘導給藥后大鼠的肝臟和腸道P-gp mRNA表達量。結果顯示，黃芩苷連續誘導給藥，可下調大鼠肝臟和腸道P-gp的表達，增加藥物在腸道吸收，提高藥物的生物利用度，這與藥動學試驗結果一致。大鼠體內試驗結果和其他學者體外試驗結果的差異，應與大鼠口服黃芩苷后，在腸道內大部分被菌群轉化為黃芩素后再吸收有關[13]。

綜上所述，黃芩苷通過下調藥物轉運蛋白P-gp的表達來提高P-gp底物在大鼠體內的吸收，提高了藥物的生物利用度，然而大鼠體內存在種類眾多的轉運蛋白，且藥物的吸收代謝還受到肝藥酶的影響[14]，因此尚需對此進行進一步的研究，更加明確其作用機制，為黃芩苷在臨床的應用奠定基礎。

[1] 文敏, 李雪, 付守廷, 等. 黃芩苷藥理作用研究新進展[J]. 沈陽藥科大學學報,2008,25(2):158-162.

Wen M, Li X, Fu S T. New research progress in pharmacological activities of baicalin[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University,2008,25(2):158-162.

[2] 于宜平, 張艷, 李紅, 等. 黃芩苷對角叉菜膠致熱大鼠解熱作用的PK-PD模型研究[J]. 中草藥, 2014,45(4): 527-531.

Yu Y P, Zhang Y, Li H,etal. Pharmacokinetic-pharmacodynamic study on antipyretic effects of baicalin on carrageenan-induced pyrexia of rats[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2014,45(4): 527-531.

[3] Feng J, Xu W, Tao X,etal. Simultaneous determination of baicalin, baicalein, wogonin, berberine, palmatine and jatrorrhizine in rat plasma by liquid chromatographytandem mass spectrometry and application in pharmacokinetic studies after oral administration of traditional Chinese medicinal preparations containing scutellaria-coptis herb couple[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(3): 591-598.

[4] Fong S Y K, Wong Y C, Zuo Z. Development of a SPE-LC/MS/MS method for simultaneous quantification of baicalein, wogonin, oroxylin A and their glucuronides baicalin, wogonoside and oroxyloside in rats and its application to brain uptake and plasma pharmacokinetic studies[J]. J Pharma Biomed Anal, 2014, 97: 9-23.

[5] Zhou S F, Zhou Z W, Li C G,etal. Identification of drugs that interact with herbs in drug development[J]. Drug Discov Today 2007:12:664-673.

[6] 蔣學華. 臨床藥動學[M]. 北京: 高等教育出版社,2007.60.

Jiang X H. Clinical Phamacokinetics[M]. Beijing: Higher Education Press, 2007.60.

[7] 張魁華, 陳瑞愛, 方炳虎, 等. 中獸藥注射劑與其他獸用注射劑的配伍[J]. 中國獸藥雜志，2007,41(10):50-52.

Zhang K H, Chen R A, Fang B H,etal. Studies on the Compatibility of Tradtional Chinese Veterinary Medical Injection and Other Veterinary Medical Injection[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2007,41(10):50-52.

[8] Tsuruo T, lida H, Tsukagoshi S，etal. Increased accumulation of vincristine and adriamycin in drug-resistant P388 tumor cells following incubation with calcium antagonists and calmodulin inhibitors[J]. Cancer Research, 1982，42(11): 4730-4733.

[9] Russell T, Stohz M, Weir S. Pharmacokinetics，pharmacodynamics and tolerance of single-and multiple-dose fexofenadine hydrochloride in healthy male volunteers[J].Clin Pharm Ther,1998,64( 6): 612-621.

[10]韋靈玉, 李靜, 劉曉亞, 等. 黃連黃芩配伍對大鼠腸黏膜P-gp活性的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012,18(08):141-146.

Wei L Y, Li J, Liu X Y,etal. Induction of P-glycoprotein in Rat Jejunum by Combined Use of Coptis-scute Herb[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2012,18(08):141-146.

[11]范嵐. 黃芩苷對CYP450代謝酶和藥物轉運體影響的研究[D]. 湖南：中南大學,2008.

Fan L. Study on Effects of Baicalin on CYP450 Metabolism Enzymes and Drug Transporters[D].Hu Nan: Central South University,2008.

[12]Miao Q, Wang Z, Zhang Y,etal. In vitro potential modulation of baicalin and baicalein on P-glycoprotein activity and expression in Caco-2 cells and rat gut sacs[J]. Pharm Biol, 2016, 54(9):1548-1556.

[13]劉太明, 蔣學華, 張梅娟, 等. 黃芩苷和黃芩素的大鼠在體腸吸收特性[J].中國藥學雜志, 2016, 41(23):1784-1787.

Liu T M, Jiang X H, Zhang M J,etal. Absorption Characteristics of Baicalin and Baicalein in Rat Small Intestine[J]. Chin Pharm J, 2006 December, 41(23):1784-1787.

[14]Eloranta J J, Kullak-Ublick G A. Coordinate transcriptional regulation of bile acid homeostasis and drug metabolism[J]. Arch Biochem Biophys,2005, 433(2): 397.

(編輯：陳希)

Effects of Baicalin on Pharmacokinetics of Fexofenadine in Ratsinvivo

WANG Bin1,2, YANG Rui1,2,LI Si-cong1,2, ZHANG Min1,2,LI Jin-liang1,2, LI Xu-ting1,2*

(1.InstituteofVeterinaryPharmacology,SichuanAnimalScienceAcademy,Chengdu610066,China; 2.SichuanAnimalBreedingandGeneticsKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610066,China)

LIXu-ting,E-mail: 676049640@qq.com

To investigate the effects of baicalin on the pharmacokinetics of fexofenadine and the expression level of P-gp in rats,36 SD rats were randomly divided into A,B and C groups, rats in A group were oral administered with baicalin(200 mg/kg), B with distilled water and C with verapamil (10 mg/kg) respectively for 7 d. On the 8th d, After 2 h of administering, 6 rats in each group were killed .The liver and jejunum were collected respectively to evaluate the P-gp mRNA expression level by real-time fluorescent quantitative PCR. The other rats were administered with fexofenadine(30 mg/kg). The concentrations of fexofenadine in plasma after administration were determined by HPLC. After administered with baicalin, Cmaxand AUC(0-12)of nifedipine were significantly increased, and the level of P-gp mRNA expression in liver and jejunum were decreased. It is concluded that baicalin is an inhibitor of P-gp, which can enhance the bioavailability of nifedipine and decrease the level of P-gp mRNA expression significantly

baicalin；fexofenadine；pharmacokinetics；real time PCR；P-gp

四川省公益性科研院所基本科研業務費項目(SASA2015A16)；四川省財政運行專項(SASA2014CZYX010) 作者簡介： 王斌，碩士，從事新獸藥的開發與應用工作。

李旭廷。 E-mail: 676049640@qq.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.10

2017-02-23

A

1002-1280 (2017) 07-0052-05

S859.79