Aurora A激酶抑制劑MLN8237對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響

張月，孫光源，姜偉華，孫健，范敬靜，信國峰，宋文麗，武雪亮，張志生(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

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Aurora A激酶抑制劑MLN8237對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響

張月，孫光源，姜偉華，孫健，范敬靜，信國峰，宋文麗，武雪亮，張志生
(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

目的 觀察Aurora A激酶抑制劑MLN8237對體外培養的人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 取乳腺癌MCF7細胞分為兩組，觀察組分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237，對照組不加MLN8237。用MTT法檢測各組細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測細胞周期，Western blotting法檢測磷酸化Aurora A(p-Aurora A)激酶和凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及細胞周期相關蛋白Cyclin B1的表達，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果 觀察組隨MLN8237濃度和培養時間增加，細胞增殖抑制率增加，10 μmol/L MLN8237作用48 h的細胞增殖抑制率最高,0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的細胞增殖抑制率均高于對照組(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，G0/G1期、S期細胞比例降低，G2/M期細胞比例升高。觀察組各濃度與對照組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，p-Aurora A激酶、Bcl-2表達降低，Bax表達升高。與對照組比較，觀察組隨MLN8237濃度增加，細胞凋亡率增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的細胞凋亡率最高(P均<0.05)。結論 MLN8237能夠抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖，并誘導細胞凋亡。

乳腺癌；MLN8237；Aurora激酶抑制劑；細胞增殖；細胞凋亡

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命。隨著分子生物學的發展，腫瘤治療進入了全新的分子靶向治療時代。與全身、廣泛性的放化療相比，靶向治療能夠高效、有選擇性地殺傷腫瘤細胞，減少對正常組織的損傷，不良反應較小。Aurora激酶家族是由Aurora A激酶、Aurora B激酶、Aurora C激酶組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其功能是進行各種有絲分裂活動和維持基因組的完整性，在細胞有絲分裂過程中起重要作用。目前已報道的Aurora激酶抑制劑大部分屬于非選擇性Aurora激酶抑制劑，存在較大的不良反應，尋找高效、低毒的選擇性Aurora激酶抑制劑是靶向藥物研究的趨勢。MLN8237是一種新型特異性抑制Aurora A激酶的小分子抑制劑，對實體瘤細胞有誘導凋亡和抑制增殖的作用[1]，但其對乳腺癌MCF-7細胞的作用研究不多。2016年3～12月，我們通過觀察MLN8237對體外培養人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其分子機制，為乳腺癌的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞由河北北方學院中心實驗室提供。MLN8237購自美國Selleck公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；p-Aurora A激酶、Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1一抗購于美國Cell Signaling Technology公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 細胞培養與分組處理 將MCF-7細胞加入含10%胎牛血清、人青霉素和鏈霉素各100 μg/mL的RPMI1640培養液中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞分為觀察組和對照組，觀察組分別加入0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的MLN8237，對照組不加MLN8237。

1.3 細胞增殖觀察 采用MTT法。取對數生長期細胞，制成1×104/mL的細胞懸液，以0.1 mL/孔接種于96孔板。培養24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續培養4 h后棄上清，加入二甲基亞砜，充分震蕩溶解顯色，使用酶標儀于波長570 nm處檢測各孔吸光度值(A值)，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組A值-觀察組A值)/對照組A值×100%。

1.4 細胞周期觀察 取對數生長期細胞，培養24 h后收集細胞，并調整細胞數至1×106/mL。加入預冷的95%乙醇固定，離心，棄乙醇，加入PI(50 μg/mL)與RNase(1 μg/mL)混合物500 μL作用15 min后，上流式細胞儀檢測1×104個細胞，用Multicycle軟件分析細胞周期。

1.5 細胞凋亡觀察 取對數生長期細胞，培養24 h后收集細胞，并調整細胞數至1×106/mL。用冷PBS洗滌，加入Binding緩沖液100 μL、FITC Annexin-Ⅴ 5 μL、PI 50 μg/mL 10 μL，室溫避光孵育15 min。加入Binding緩沖液400 μL到細胞懸液中，繼續孵育20～30 min。上流式細胞儀FACScan測定凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。

1.6 細胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax及Cyclin B1表達檢測 采用Western blotting法檢測細胞中p-Aurora A激酶和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及細胞周期蛋白Cyclin B1表達。取細胞蛋白樣品30 μg，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，37 mA恒流1 h將蛋白電轉移至PVDF膜上，用含5%牛奶TBST封閉纖維素膜0.5 h，加入一抗(抗體稀釋比例為1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(抗體稀釋比例為1:10 000)，室溫孵育1 h后TBST洗滌3次，ECL顯影，曝光。以目的條帶與內參條帶的光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖抑制率比較 觀察組MLN8237濃度較高組的細胞增殖抑制率較濃度較低組升高，作用48 h時的細胞增殖抑制率較24 h時升高。0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用24、48 h的細胞增殖抑制率均高于對照組(P均<0.05)，10 μmol/L MLN8237作用48 h的細胞增殖抑制率最高。見表1。

表1 兩組細胞增殖抑制率比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞周期比較與對照組比較 觀察組MLN8237濃度較高組的G0/G1期、S期細胞比例較濃度較低組下降，G2/M期細胞比例升高。觀察組各濃度與對照組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組細胞周期比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組細胞凋亡率比較 觀察組加入MLN8237 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L培養24 h后，細胞凋亡率分別為2.67%±0.22%、5.26%±0.34%、8.41%±0.11%、11.04%±0.21%、29.59%±1.76%，對照組為2.51%±0.17%。與對照組比較，觀察組0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下細胞凋亡率均升高(P均<0.05)。觀察組MLN8237濃度較高組的細胞凋亡率較濃度較低組增加，10 μmol/L MLN8237作用24 h的細胞凋亡率最高(P均<0.05)。

2.4 兩組細胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相對表達量比較 與對照組比較，觀察組0.01、0.1、1、10 μmol/L MLN8237作用下細胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Cyclin B1蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高(P<0.05)。觀察組MLN8237濃度較高組的p-Aurora A激酶、Cyclin B1、Bcl-2蛋白表達較濃度較低組下降，Bax蛋白表達逐漸升高(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3 兩組細胞p-Aurora A激酶、Bcl-2、Bax、Cyclin B1蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

Aurora激酶是中心體相關激酶，存在于真核細胞內，在中心體復制、兩極紡錘體形成、染色體重排和染色體檢查點檢測等重要的有絲分裂過程中發揮重要作用[2]。Aurora激酶的異常表達很可能干擾有絲分裂中檢查點的功能，導致遺傳不穩定和誘發腫瘤增長[3]。Aurora激酶與惡性腫瘤的關系，使其作為靶點治療癌癥成為可能。選擇性Aurora激酶抑制劑的研究主要是針對Aurora B激酶，針對Aurora A激酶的選擇性抑制劑很少[4]。但相對于Aurora B激酶而言，Aurora A激酶在卵巢癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈過表達，對乳腺癌的治療具有指導意義[5]。Aurora A激酶的功能與中心體的分離和成熟以及紡錘體裝配有關，通過激活紡錘體的檢查點，從而導致有絲分裂終止，形成異倍體[6]。Aurora A激酶高表達打亂了中心體和微管的動態平衡，基因組穩定性發生改變，從而導致腫瘤發生[7]。Aurora A激酶的mRNA、蛋白表達在G1期和S期均處于相當低的水平，在G2期和M期升高至峰值，當一個細胞周期結束進入下一個周期的G1期時，Aurora A激酶的表達迅速下降[8]。

作為第2代Aurora A激酶特異性抑制劑MLN8237，對實體瘤和血液系統惡性腫瘤表現出了良好的療效[9]。Aurora A激酶通過與其底物結合，發生自身磷酸化從而被激活，激活Aurora A激酶的底物和Aurora A激酶抑制劑之間的平衡對正常的有絲分裂是非常重要的[10]。本研究觀察了MLN8237對乳腺癌MCF-7細胞的增殖和凋亡的影響，結果顯示，與對照組比較，10 μmol/L MLN8237作用于MCF-7細胞24、48 h的細胞增殖抑制率分別達到64.88%±0.01%、82.21%±0.01%，與對照組比較，隨著MLN8237濃度增加，細胞凋亡率升高，凋亡細胞明顯增加。

MLN8237是潛在的選擇性Aurora激酶抑制劑，在腫瘤細胞中對Aurora A激酶的選擇性大于Aurora B激酶，可抑制磷酸化Aurora A激酶的表達。Cyclin B1是細胞周期中的一種重要的蛋白，使細胞通過G2/M期的檢查點，促進細胞G2/M期轉換，它在有絲分裂中后期被降解，促進有絲分裂完成，促使細胞周期的運行[11，12]。通過MLN8237藥物干擾使細胞Cyclin B1表達降低，G2/M期進展延遲[13]，抑制有絲分裂細胞的聚集，凋亡相關蛋白Bcl-2與Bax的表達呈相反趨勢，即Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，細胞進入凋亡。本研究顯示，加入MLN8237后，細胞周期出現明顯的G2/M期阻滯，G0/G1期、S期細胞比例降低，G2/M期細胞比例升高。同時，流式細胞術Annexin-Ⅴ/PI雙染顯示隨著MLN8237濃度的增加，細胞凋亡率升高，凋亡細胞增加。

Aurora A激酶轉化為p-Aurora A激酶發揮活性。MLN8237干擾后，p-Aurora A激酶表達減少，Cyclin B1被激活，從而延遲G2/M期的進展，抑制有絲分裂細胞的聚集，使細胞發生增殖抑制。本研究顯示，MCF-7細胞p-Aurora A激酶表達隨MLN8237濃度增加而降低。隨藥物濃度增加，Cyclin B1表達降低，細胞出現增殖抑制及細胞周期阻滯，說明細胞的增殖抑制最終可能與下調Cyclin B1表達、不能有效調節G2/M期細胞周期進展有關。

綜上所述，MLN8237能夠抑制乳腺癌細胞中Aurora A激酶磷酸化，下調Cyclin B1表達，使細胞發生G2/M期阻滯，形成異倍體細胞，抑制細胞周期進程；Bcl-2表達下降，Bax表達增加，抑制乳腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，可為乳腺癌的靶向治療提供理論基礎。

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醫藥學名詞常見錯誤及正確寫法

藥品名稱：錯誤(正確)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，維甲酸(維A酸)，雙磷酸鹽(雙膦酸鹽)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博萊霉素(博來霉素)，開浦蘭(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(異丙嗪)，四乙銨(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大環內脂類(大環內酯類)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，頭胞哌酮(頭孢哌酮)。

疾病及其相關名稱：錯誤(正確)

甲狀腺機能(甲狀腺功能)，血沉(紅細胞沉降率)，X光片(X線片)，帕金森癥(帕金森病)，食道(食管)，適應征、適應癥(適應證)，禁忌征、禁忌癥(禁忌證)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，腦梗塞(腦梗死)，毒副反應(不良反應)，肌肉注射(肌內注射)，心率失常(心律失常)，中風(卒中)，生理機能(生理功能)，返流(反流)，血液動力學(血流動力學)，機能(功能)，人流(人工流產)，藥動學(藥代動力學)，綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)，機理(機制)，圍產期(圍生期)，氧和指數(氧合指數)，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管緊張素轉換酶(血管緊張素轉化酶)，血管緊張肽轉換酶抑制劑(血管緊張素轉化酶抑制劑)，咳血(咯血)，心房纖顫(心房顫動)，腦溢血(腦出血)，穩定性心絞痛(穩定型心絞痛)，法樂四聯癥(法洛四聯癥)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，視網膜神經膠質瘤(視網膜母細胞瘤)，剖腹產術(剖宮產術)。

其他：錯誤(正確)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滯(黏滯)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘質沙雷菌(黏質沙雷菌)，層黏聯蛋白(層黏連蛋白)，機率、幾率(概率)，脫臘(脫蠟)，側枝循環(側支循環)，縱膈(縱隔)，紅血球(紅細胞)，白血球(白細胞)。

Effects of Aurora kinase inhibitor on proliferation and apoptosis of breast cancer cells

ZHANGYue,SUNGuangyuan,JIANGWeihua,SUNJian,FANJingjing,XINGuofeng,SONGWenli,WUXueliang,ZHANGZhisheng

(FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China)

Objective To investigate the effects of Aurora kinase inhibitor MLN8237 on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells cultured in vitro. Methods MCF7 cells were divided into two groups, including the control group (without MLN8237) and the observation group (added with 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 μmol/LMLN8237). The cell proliferation inhibitory rate was examined by MTT assay. Cell cycle of MCF7 cells was determined by flow cytometry. The expression levels of phosphorate-Aurora A (p-Aurora A), apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, and cell cycle-related Cyclin B1 protein were detected by Western blotting. The apoptotic rate was tested by Annexin V-FITC and PI staining. Results MLN8237 (0.01, 0.1, 1, 10 μmol/L ) significantly inhibited the proliferation of MCF7 cells after 24-hour or 48-hour treatment in a dose-dependent and time-dependent manner in the observation group as compared with that of the control group, and the highest inhibition was found at 10 μmol/L MLN8237 after 48-hour treatment (allP<0.05). With the increasing concentrations of MLN8237, the percentage of cells in G2/M phase increased, the percentage of cells in G0/G1and S decreased in the observation group as compared with that of the control group, and there was statistically significant difference between these two groups (allP<0.05). Compared with the control group, with the increasing concentrations of MLN8237, the expression of p-Aurora A kinase and Bcl-2 decreased, the expression of Bax increased, the apoptosis rate increased and the highest apoptotic inhibition rate was found at 10 μmol/L MLN8237 after 24-hour treatment in the observation group (allP<0.05). Conclusion MLN8237 inhibits the proliferation and induces the apoptosis of MCF7 cells.

breast carcinoma; MLN8237; Aurora kinase inhibitor; cell proliferation; apoptosis

河北省醫學科學研究重點課題(ZD20140243)。

張月(1984-)，女，碩士，主治醫師，主要研究方向為乳腺疾病的診治與基礎研究。E-mail: zhangyue906@163.com

張志生(1970-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要研究方向為乳腺疾病的基礎與臨床診治。E-mail: yfyzzs@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.004

R737.9

A

1002-266X(2017)26-0013-04

2017-03-18)