薏苡仁提取物對裸鼠肝癌移植瘤生長的影響及機制

陳萍，胡偉結，游贛花，張閩閩(貴州醫科大學附屬腫瘤醫院，貴陽550004；2貴州醫科大學附屬口腔醫院；貴州省食品藥品檢驗所)

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·基礎研究·

薏苡仁提取物對裸鼠肝癌移植瘤生長的影響及機制

陳萍1，2，胡偉結1，游贛花3，張閩閩1
(1貴州醫科大學附屬腫瘤醫院，貴陽550004；2貴州醫科大學附屬口腔醫院；3貴州省食品藥品檢驗所)

目的 觀察薏苡仁提取物對裸鼠肝癌移植瘤瘤體生長情況及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響，探討薏苡仁治療肝癌的機制。方法 建立裸鼠肝癌模型，將24只成模裸鼠隨機分成模型組、薏苡仁低劑量組、薏苡仁高劑量組各8只，分別給予生理鹽水、0.08 g/mL的薏苡仁混懸劑、0.16 g/mL的薏苡仁混懸劑連續灌胃給藥40 d。收集瘤體標本，測量腫瘤體積、瘤重，計算抑瘤率；HE染色法觀察瘤體組織細胞形態；ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結果 與模型組相比，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積減小、瘤重降低(P均<0.01)；鏡下見薏苡仁低、高劑量藥組生長狀態良好的腫瘤細胞數量明顯減少，出現面積大小不等的核濃縮或核溶解的壞死細胞群。薏苡仁高劑量組血清TNF-α水平較模型組降低(P<0.05)，薏苡仁低劑量組與模型組比較無統計學差異(P>0.05)；薏苡仁低、高劑量組較模型組血清IL-1β水平均升高，IL-6水平均降低(P<0.05或<0.01)。結論 薏苡仁可能通過調節血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，進而有效抑制裸鼠肝癌移植瘤生長。

薏苡仁；肝腫瘤；移植瘤;腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β；白細胞介素6；裸鼠

原發性肝癌(以下簡稱肝癌)主要包括肝細胞癌、肝內膽管細胞癌和肝細胞癌-肝內膽管細胞癌混合型等不同病理類型。在我國，肝細胞癌占肝癌的85%～90%[1]。我國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數的51%[2]。薏苡仁是禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。我們的前期研究發現，薏苡仁粉口服幾乎無不良反應，僅個別患者在外敷時出現皮膚干燥或輕微脫屑，停用后癥狀消失[3]。2016年，我們通過觀察口服薏苡仁對荷瘤裸鼠瘤體生長及細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響，旨在為薏苡仁治療肝癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級BAL/c裸鼠30只，4～6周齡，雄性，體質量18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。人肝癌SMMC-7721細胞株由中國科學院上海細胞研究所提供。薏苡仁藥材購于貴州同濟堂藥房，經麩炒炮制，粉碎，過300目藥篩，用注射用水配成0.08 g/mL和0.16 g/mL的混懸劑備用。0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司)。Thermo全波長酶標儀(美國Thermo公司)，臺式冷凍高速離心機(德國5804R型Eppendorf)，BS210S電子天平(德國，賽多利思公司)，TNF-α、IL-1β及IL-6酶聯免疫吸附試劑盒(聯科生物技術有限公司)。

1.2 模型制作與分組處理 取對數生長期SMMC-7721細胞，用0.25%胰酶消化，PBS沖洗，離心收集細胞。用0.9%氯化鈉注射液懸浮細胞，調整細胞密度為5×106/mL。每只裸鼠分別取細胞懸液0.2 mL接種于頸背部皮下，3 d后見瘤體長出。將成模的24只裸鼠隨機分為模型組、薏苡仁低劑量組、薏苡仁高劑量組，每組8只。薏苡仁低、高劑量組分別給予0.08、0.16 g/mL的薏苡仁混懸劑灌胃，模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，均0.5 mL/次、2次/d，連續40 d。

1.3 移植瘤體積、瘤重及抑瘤率的測算 觀察3組荷瘤裸鼠實驗期間的飲食和活動狀態。末次給藥24 h后采用頸椎脫臼法處死荷瘤裸鼠，完整剝離出裸鼠的瘤體。用游標卡尺測量瘤體最大直徑LD和最小直徑SD，以LD×SD2×0.5計算移植瘤體積。稱取瘤體質量，計算抑瘤率，抑瘤率=(模型組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.4 瘤體組織細胞形態學觀察 將腫瘤用甲醛固定，石蠟包埋，切5 μm厚切片。行常規HE染色，鏡下觀察腫瘤細胞形態。

1.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 裸鼠眼眶取血，離心分離血清，-20 ℃保存備用。采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結果

2.1 三組移植瘤體積、瘤重及抑瘤率比較 三組荷瘤裸鼠在實驗過程中，除模型組在最后6 d攝食量和活動量稍有減少外，薏苡仁低、高劑量組均無明顯變化。與模型組比較，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積縮小，瘤重減少(P均<0.01)。薏苡仁高、低劑量組間瘤體積和瘤重比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。薏苡仁低、高劑量組的抑瘤率分別為52.12%、56.63%，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 三組移植瘤體積、瘤重比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.2 三組瘤體組織細胞形態 鏡下見模型組大多數腫瘤細胞生長狀態良好，呈多角形或不規則形，核大深染，核分裂象多見；薏苡仁低劑量組多數細胞出現壞死的初期表現核濃縮，少數細胞出現壞死的末期表現核溶解；薏苡仁高劑量組大多數細胞呈現核濃縮的壞死表現，且有大面積的核溶解壞死細胞群出現。

2.3 三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 薏苡仁高劑量組血清TNF-α、IL-6水平均低于模型組，IL-1β水平高于模型組；薏苡仁低劑量組血清IL-6水平低于模型組，IL-1β水平高于模型組(P<0.05或<0.01)。見表2。

表2 三組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

肝癌因發病隱匿，確診時多為晚期，患者預后較差。其發病機制主要與乙型或丙型肝炎病毒感染密切相關，非病毒性因素則與過度飲酒、發霉食物、不潔飲水等相關。目前研究認為，肝細胞癌的發病機制與原癌基因激活、抑癌基因的失活、多種分子信號通路異常活化、相關蛋白質異常表達等因素有關[4]。目前對肝癌的治療多采用手術切除為主，介入、放療、化療等為輔的綜合治療方案，但高復發率、高病死率一直是困擾臨床的棘手難題。

薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁。2015年版《中國藥典》一部里載明薏苡仁飲片的功能與主治項為用于水腫、贅疣、癌腫等。且我國具有自主知識產權的中藥注射用薏苡仁油(薏苡仁有效活性成分制劑)的說明書也明確載明用于原發性肝癌治療。既往有報道指出，薏苡仁油注射液和薏苡仁脂肪酸在體外對肝癌細胞具有良好的抗腫瘤活性，其作用機制可能與其誘導細胞凋亡、上調抑癌基因、下調癌基因、抑制G2/M細胞周期有關[5，6]。我們的前期研究發現，薏苡仁可提高細胞免疫功能，調節T淋巴細胞的水平、恢復Th1/Th2亞群的動態平衡，發揮抗病毒作用[7]。國外學者[8]報道，薏苡仁提取物α-單亞麻酯有抗病毒作用。然而目前多見注射用薏苡仁油治療肝癌的報道，鮮有內服薏苡仁報道。而注射用薏苡仁油存在脂過敏、靜脈炎及血管硬化等不良反應，導致患者用藥不便且痛苦。本研究顯示，與模型組比較，薏苡仁低、高劑量組的瘤體積及瘤重均顯著減少。表明不同劑量的薏苡仁內服均對人肝癌細胞移植瘤有一定的抑制作用。

流行病學調查表明，炎癥是導致腫瘤發生發展的主要因素之一[9]。肝細胞癌是炎癥相關性腫瘤，因此，探討炎癥與肝細胞癌的關系有助于篩選肝癌的治療藥物與治療靶點。有研究指出在肝癌的炎性微環境中，TNF-α、IL-1β、IL-6細胞因子不僅可由腫瘤細胞分泌，還能產生于炎癥反應過程。它們互為因果，相互促進對方的表達，共同組成和維持有利于肝癌細胞生長的炎性微環境。

TNF-α是炎癥反應的始動因子，既能由單核/巨噬細胞、肥大細胞及淋巴細胞等多種細胞釋放產生，還能以自分泌方法促進自身合成。其對多種有助于腫瘤細胞發生、發展及逃逸的因子高表達有誘導作用，是改變腫瘤細胞微環境的關鍵因素[10]。賈綺賓等[11]報道，肝癌患者血清TNF-α水平明顯高于肝硬化患者，且治療后隨著病情好轉而逐漸降低，隨病情惡化而明顯上升。表明抑制血清TNF-α水平的高表達可能成為有效治療肝癌的新靶點。本研究結果顯示，薏苡仁高劑量組血清TNF-α水平較模型組降低，表明高劑量薏苡仁能明顯抑制血清TNF-α的高表達，從而減少炎性因子分泌，從而減小腫瘤體積、減輕瘤重等發揮抑瘤作用。雖然薏苡仁低劑量組血清TNF-α水平較模型組有所降低，但差異無統計學意義。提示高劑量薏苡仁降低血清TNF-α水平的作用更佳。

IL-1β是較強的炎癥反應繼發因子，其通過激活c-Jun氨基末端激酶促進肝星狀細胞增殖并分泌細胞外基質。這種作用既有利于炎癥、損傷的愈合，也會導致肝纖維化[12]。還有研究[13]認為，IL-1β細胞因子在肝臟慢性炎癥中的高表達不僅可誘導其他細胞因子如IL-2、IL-6、TNF-α的分泌，引發免疫反應以清除病毒，也能促進病毒性肝炎演變的肝細胞性肝癌的發生、發展、侵襲與遷移。在肝癌的發展與轉歸過程中，IL-1β參與了腫瘤細胞分裂增殖、腫瘤侵襲轉移、腫瘤細胞凋亡、機體免疫反應等,表現出了多樣性的生物效應。本研究結果顯示，薏苡仁高、低劑量組均能提高血清IL-1β水平，通過上調血清IL-1β表達，促進炎癥減退和病毒清除。

IL-6是促炎細胞因子，它能通過刺激活化B細胞的增殖而分泌抗體,刺激T細胞的增殖及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的活化,刺激肝細胞合成急性期蛋白而參與炎癥反應[14]。同時還能作用于肝內的免疫細胞和其他基質細胞，激活STAT3信號通路，使之表達更多的炎癥因子如IL-6、TNF-α、IL-10等，維持有利于肝癌細胞生長的炎性微環境，促進肝癌進展[15]。李丹等[16]報道，IL-6具有提高肝癌細胞增殖、轉移和侵襲能力的作用。Meta分析結果顯示，肝細胞癌患者血清IL-6不但高于正常人，而且高于肝硬化患者和慢性肝炎患者，同時文獻指出這個結果可為以IL-6細胞因子為靶點的抗炎治療肝癌方案提供決策依據[15]。本研究結果表明，薏苡仁不同劑量組均具有下調荷瘤裸鼠血清IL-6表達的作用，提示薏苡仁可能通過下調血清IL-6水平，抑制肝癌細胞增殖或轉移。

綜上所述，薏苡仁可降低肝癌瘤體體積和瘤重、誘發瘤體細胞變性壞死，其機制可能是通過影響血清TNF-α、IL-6、IL-1β表達，減輕肝癌組織細胞的炎性損害，從而抑制肝癌的發生、發展及轉移。

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貴州省科學技術基金項目(黔科合LH字2014-7144)；貴州省科學技術基金項目(黔科合J字2012-2357)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.008

R735.7

A

1002-266X(2017)26-0029-03

2016-12-12)