蕨麻多糖提取純化及生物活性研究進展

沈蓉 劉迪生 侯晨晨 劉迪 程菊 白德成

摘要：蕨麻為傳統中藥，且為藏醫常用草藥，主要分布于我國甘肅、青海、西藏等地。蕨麻多糖是蕨麻的多種活性成分之一，近年來國內外學者對其進行了初步研究，顯示其具有抗氧化、抗衰老、抗菌、調節免疫、調節血糖等多種功效。本文對近年蕨麻多糖的提取、純化、生物活性研究進行綜述，為深入研究及開發利用提供思路。

關鍵詞：蕨麻多糖；提取；純化；生物活性；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.031

中圖分類號：R284.2；R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0125-04

Research Progress in Extraction， Purification and Bioactivities of Potentilla Anserine Polysaccharide SHEN Rong1， LIU Di-sheng2， HOU Chen-chen1， LIU Di1， CHENG Ju1， BAI De-cheng1 （1. School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 2. The First Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

Abstract： As a common Tibetan medicine， Potentilla anserine L. is a kind of important Chinese materia medica， which is mainly distributed in Gansu， Qinghai and Tibet Provinces. As the active constituent from Potentilla anserine L.， potentilla anserine polysaccharide has received initial research by researchers in abroad and at home. It is suggested that potentilla anserine polysaccharide exhibits various functions including antioxidation， anti-aging， immunoregulation， inhibiting bacteria and anti-diabetic. This article reviewed the research on extraction， purification and bioactivities of potentilla anserine polysaccharide， which is expected to provide ideas for the further study and research and development.

Key words： potentilla anserine polysaccharide； extraction； purification； bioactivities； review

蕨麻為薔薇科植物鵝絨委陵菜屬植物蕨麻Potentilla anserina L.的塊根。藏名又稱戳瑪、卓老灑曾、延壽草、仙人果等。主要產于我國華北、東北和西北等地，遍布于海拔500～4100 m山坡草地及草甸。《新華本草綱要》載青藏高原產蕨麻塊根發育最良。蕨麻因根塊膨大、富含淀粉，產地居民常將其用于日常飲食，認為具有滋補作用，食之益人。蕨麻性甘、味溫，可養陰生津、益胃健脾、益補血氣，兼止血、止瀉、止咳功效，能治婦人崩中、下血、吐血、癰瘡瘧疾、脾虛腹瀉、下痢等[1]。藏醫學著作《月王藥診》載治“小腸出血，干燥，粘連胃壁，眼不閉合之癥”；《四部醫典》亦記載蕨麻治療出血癥及脾胃虛弱等疾病。近年來，蕨麻在中醫臨床上也有廣泛應用，如治療狼瘡性腎炎、慢性腎功能衰竭、大病初愈身體虛弱

基金項目：甘肅省中小企業創新基金（1205FCCA27）；中央高校基本科研業務費專項基金（lzujbky-2016-61）

通訊作者：白德成，E-mail：bdc@lzu.edu.cn

等。因此，蕨麻具有較高的食用和藥用價值。

蕨麻含有多種化學成分，如多糖、萜類、酚類、黃酮類等[2-4]，其中蕨麻多糖具有明確的生物學活性，可發揮抗氧化應激、抗衰老、調節免疫、抗炎、抗菌等多方面的藥理作用。本文就蕨麻多糖的提取、純化及其生物活性進行整理，為蕨麻開發利用及后續研究提供參考。

1 提取工藝

蕨麻多糖有多種提取方法，一般用水、稀鹽或稀堿溶液提取得到粗多糖，酸性條件下溫度過高易引起糖苷鍵斷裂，故也可采用復合酶熱水浸提法。

常見提取方法為水提醇沉法。將蕨麻粉碎，石油醚等有機溶劑脫脂，按一定液料比加入蒸餾水，沸水浴中提取一段時間，取上清液加入乙醇或甲醇沉淀，過夜后離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥，制得蕨麻粗多糖。此方法將溫度、時間、料液比作為單因素條件，分別測定不同條件下蕨麻多糖的提取率，以確定適合蕨麻多糖提取的最佳工藝條件。通過3種單因素正交試驗和極差分析，提取溫度為90 ℃，時間為1 h，料液比為1∶15，多糖的提取率為5.72%±0.37%[5]。該方法3種因素中料液比對提取率影響最大，其次是時間、溫度，故選擇適宜的料液比至關重要。隨著料液比的提高，多糖得率出現先升后降的現象；隨著溫度的升高，多糖向提取液的傳質速率增加，黏度逐漸降低，有利于組織中多糖浸出，但溫度過高會導致多糖降解甚至失活。因此，采用不同的方法所得到的多糖濃度及組分也有差異。

丁耀光等[6]利用索氏提取法和超聲波輔助提取法提取蕨麻粗多糖后純化，苯酚-硫酸法測定多糖含量并繪制標準曲線。結果表明，索氏提取法多糖含量為14.34 mg/g，超聲波輔助提取法蕨麻多糖含量高達24.25 mg/g。

王峰等[7]以水為溶劑，微波輔助提取蕨麻多糖，得到最佳工藝條件為液固比3、浸提溫度90 ℃、浸提時間120 min，Sevage法除蛋白后蕨麻多糖平均含量可達83.9 mg/kg。

高丹丹等[8]建立了蕨麻多糖的提取率數學模型，用Box-Behnken中心組合試驗設計原理優化提取工藝。采用水提醇沉法提取蕨麻粗多糖，以丙酮、乙醚除去雜質，分析多糖的最佳提取調件為液料比（mL/g）20.3∶1、浸提時間4.4 h、溫度82 ℃，蕨麻多糖提取率可達24.53%±0.24%。

陳煉紅等[9]用復合酶水解法提取蕨麻多糖，在單因素試驗的基礎上對復合酶配比和提取工藝進行正交試驗。結果表明，纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶三種酶的最佳酶配比及酶解時間為60 min，復合酶法提取法的優化工藝條件為料液比1∶30、pH值4.5、溫度45 ℃，蕨麻多糖得率為8.12%，優于常規水提法。

2 純化工藝

提取得到的蕨麻粗多糖為多種單糖、蛋白質、色素等的混合物，雜質存在增加了多糖的吸濕性，其所帶電荷可吸附大量其他雜質，使雜質去除變得更為困難。此外，蛋白質吸附多糖，增加了多糖的分級、分離難度。故不能以通常化合物的純度標準來衡量，需經純化、分離才能得到一定分子量范圍的均一組分即純品多糖。

脫蛋白主要方法有酶法、Sevage法、酶法+Sevage法。酶法根據酶解時間、pH值、酶用量、酶解溫度4個單因素確定工藝條件，以脫蛋白率和多糖提取率為主要評價指標。該法符合對多糖組成、結構、功能的研究需要，操作條件較平穩，能較好保持多糖活性，避免使用有機試劑產生的危害。Sevage法是在蕨麻粗多糖溶液中，加一定體積Sevage試劑（氯仿與正丁醇按一定比例混合），充分混勻后靜置一段時間，于分液漏斗中分層后棄去下層有機溶劑層及中間的蛋白質層。需反復多次方能達到較好的脫蛋白質效果，故除單因素外，還需考慮次數對脫蛋白效果的影響。該法以蛋白質的去除率為主要評價指標，較好的脫蛋白工藝為靜置10 min、搖振30 min、氯仿∶正丁醇（V/V）5∶1、料液比1∶1[10]。酶法+Sevage法是使用最優方案酶法和Sevage法相結合的脫蛋白法，在蛋白酶最佳工藝條件下，可提高蕨麻多糖脫蛋白率、降低損失率。

純化的蕨麻多糖呈白色，但因提取方法缺陷和植物組織成分復雜性，提取的蕨麻多糖液多呈褐色、黃色或紅色，對其分離、純化、定量、定性、結構測定、藥效實驗均有較大影響。因此，脫色在蕨麻多糖純化過程中也十分重要。常用脫色方法有活性炭法和樹脂吸附法。活性炭可吸附芳香族有機物，對不帶電荷的物質吸附力較強，而對帶電荷的物質吸附力較弱；樹脂吸附法采用的樹脂理化性質穩定，不溶于酸、堿及有機溶劑，不受鹽類及低分子化合物的影響，可有選擇地吸附有機物質。

純化后的蕨麻多糖由多種單糖成分組成，可用超離心、高壓電泳、層析及高效液相色譜法等分析各組分。劉春蘭等[11]采用水提法提取蕨麻粗多糖后，以酶法脫淀粉及蛋白，經紙層析及高效液相色譜分析，得出蕨麻多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，為酸性雜多糖。夏蓮等[12]用毛細管電泳分析法，以1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮作柱前衍生劑，水提醇沉并經Savage法脫蛋白后，從蕨麻多糖中精細分離出9種單糖組分，其中阿拉伯糖、半乳糖及半乳糖醛酸含量最高，其次為葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸，木糖、甘露糖及巖藻糖含量較低。

3 生物活性

中藥的多糖成分作為中藥新藥開發的重要方向之一，受到學者關注，其生物活性及藥理作用機制也成為研究熱點。蕨麻多糖生物活性主要體現在抗氧化應激、抗衰老、免疫調節、抗菌等方面。

3.1 抗氧化及衰老

蕨麻多糖可通過清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基對抗氧化應激，降低細胞內活性氧及自由基水平，從而抑制細胞凋亡[13]。采用必需微量元素硒修飾蕨麻多糖，硒化修飾的蕨麻多糖體外抗氧化能力及自由基清除率可顯著提高[14]。

韋薇等[15]建立新生SD鼠心肌細胞缺氧損傷模型，觀察不同濃度蕨麻多糖對心肌細胞損傷的保護作用；建立小鼠常壓缺氧模型，予不同濃度蕨麻多糖灌胃。結果表明，蕨麻多糖能明顯降低心肌細胞乳酸脫氫酶漏出、改善心肌細胞活力可提高缺氧小鼠存活率、延長生存時間。

張永慧等[16]建立大鼠腦缺血再灌注模型，術前連續予蕨麻多糖7 d。結果表明，蕨麻多糖能明顯改善缺血再灌注引起的神經系統功能缺失、降低腦組織炎癥因子丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α及白細胞介素（IL）-1β含量，提高腦組織抗氧化能力。

研究表明，予蕨麻多糖后采用過氧化氫誘導小鼠脾臟淋巴細胞凋亡，能明顯改善脾淋巴細胞氧化損傷、減少細胞內凋亡小體形成，在一定范圍內呈劑量依賴性[17]。低濃度蕨麻水提物可呈劑量依賴性清除DPPH自由基，抑制肌纖維細胞IL-6產生，對細胞骨架纖維肌動蛋白及人結腸細胞內細胞因子的表達均有一定的調節作用[18]。此外，蕨麻水提取物可增加小鼠腦、肝及血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低MDA水平，提高腦內Na+-K+-ATP酶水平，延緩D-半乳糖所致衰老，改善學習記憶能力[19]。

3.2 調節免疫

免疫系統具有重要的防御屏障作用，免疫功能低下將導致機體內環境的穩定性下降、易感性增加。用環磷酰胺誘導BALB/c小鼠免疫抑制模型，予蕨麻多糖連續預處理5 d再予環磷酰胺，可緩解環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠胸腺及脾臟組織萎縮，改善免疫抑制劑對組織超微結構的影響，促進脾淋巴細胞增殖，活化單核-巨噬細胞系統，刺激吞噬細胞吞噬功能的發揮，改善血清炎癥因子IL-10、干擾素-γ（IFN-γ）水平，顯著提高免疫抑制小鼠的免疫功能[20-21]。不同濃度的蕨麻多糖可改善急性低劑量鎘染毒小鼠的脾、胸腺指數，增加CD3+、CD4+的脾淋巴細胞數目，促進鎘染毒小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ及可溶性淋巴細胞活化基因-3[22]。體外實驗表明，蕨麻多糖可通過激活鳥苷酸環化酶提高小鼠脾淋巴細胞內環磷酸鳥苷水平，從而發揮免疫調節作用，還可升高細胞內Ca2+水平、影響蛋白激酶C信號通路、活化淋巴細胞，對細胞內花生四烯酸信號分子的表達亦有調節作用[23]。此外，蕨麻多糖可提高大鼠運動能力，抑制運動性免疫機能低下的發生，加速運動后的機體恢復[24]。因此，蕨麻多糖對機體的免疫功能具有明顯的調節作用。