金華地區慢性乙型肝炎患者HBV基因型及耐藥基因位點突變類型分析

劉穎 朱以軍 王月

金華地區慢性乙型肝炎患者HBV基因型及耐藥基因位點突變類型分析

劉穎 朱以軍 王月

目的 分析金華地區慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布特征及HBV耐藥基因位點突變情況，并探討兩者的關系。方法 選取104例經核苷（酸）類似物治療的慢性乙型肝炎患者為研究對象，采用Sanger雙脫氧法測序技術檢測患者血清HBV的基因型和10種常見的HBV P區耐藥基因位點突變情況，并分析兩者關系。 結果 本組慢性乙型肝炎患者中，HBV B基因型占46.15%，C基因型占53.85%，未發現其他基因型。檢測出發生耐藥基因位點突變61例，突變率為58.65%，其中C基因型占65.57%，B基因型占34.43%。HBV P區耐藥基因位點突變率最高的為M204V/I（73.85%），其次為L180M（36.92%）和A181V/T（23.08%）。HBVP區耐藥基因發生單位點突變的占50.82%，其中M204I突變類型最多（29.51%）；發生多位點突變的占49.18%；以M204I和M204V/I+L180M兩種突變類型最常見。HBVC基因型的患者耐藥基因突變率高于B基因型的患者（71.43%vs 43.75%，P＜0.05），其中C基因型的患者A181V/T位點突變率高于B基因型的患者（14.29%vs 2.08%，P＜0.05）。 結論 金華地區慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型為主；HBV P區耐藥基因位點突變類型以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易發生耐藥突變，且更易發生A181V/T位點突變。

慢性乙型肝炎 耐藥突變 基因型 核苷（酸）類似物

HBV感染呈世界性流行，WHO估計全世界約有3.5～4億人感染HBV[1]。我國是一個肝炎大國，據2006年全國乙型肝炎流行病學調查數據顯示，我國1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率為0.96%。據此推算，我國現有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬人[2-3]。目前HBV已發現有A～I 9個基因型，在我國以C基因型和B基因型為主。研究表明，HBV基因型與疾病進展和干擾素（IFN）α治療效果有關；與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現HBeAg血清學轉換，較少進展為慢性肝炎、肝硬化和原發性肝癌；HBeAg陽性患者對IFNα治療的應答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型[1]。慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物主要為兩大類：IFN和核苷（酸）類似物（NAs）。目前臨床上應用的抗HBV的NAs有5種：拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定和替諾福韋酯。隨著NAs長期廣泛的應用，HBV反轉錄酶（RT）基因的突變也明顯增加，使慢性乙型肝炎的抗病毒治療變得更為復雜。因此，本研究探討金華地區HBV基因型分布和慢性乙型肝炎患者HBV P區耐藥基因突變情況，以期為臨床慢性乙型肝炎抗病毒治療提供參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年10月至2016年10月本院收治的慢性乙型肝炎患者104例，其中男77例，女27例；年齡22～69（42.8±12.1）歲。所有患者均符合2011年中華醫學會肝病學和感染病學分會聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，且所有患者都有NAs抗病毒治療的用藥史。

1.2 儀器和試劑 ABI3500測序儀（美國ABI公司）、PCR擴增儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、高速低溫離心機（美國Thermo scientific公司，型號FRESCO 17）、凝膠成像分析儀（美國BIO-RAD公司，型號ChemiDoc XRS+）、瓊脂糖凝膠電泳儀（美國BIO-RAD公司）。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、普通DNA純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、HBV耐藥基因突變檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）、PCR擴增試劑（日本TaKaRa公司，型號PrimeSTAR HS PREMIX）。

1.3 標本采集 采用促凝分離膠真空采血管采集患者外周血3ml，離心后將血清轉移到1.5ml離心管中冷凍保存備用。

1.4 HBV P區耐藥基因突變位點 包括10個位點：I169T、V173L、L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、A194T、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I。該10個位點均為國內外臨床公認，且為美國FDA批準用于治療HBV的所有NAs的耐藥突變相關位點。

1.5 HBV基因型和HBV P區耐藥基因檢測 HBV P區耐藥基因檢測采用Sanger雙脫氧法測序技術，使用HBV耐藥基因突變檢測試劑盒進行。PCR擴增出HBV P區基因，擴增產物經凝膠電泳鑒定和純化后，進行測序PCR，將測序PCR產物純化后在ABI3500測序儀上進行測序。最后將測序得到的基因序列在CelLoud平臺數據庫進行比對，得到HBV基因型和耐藥突變位點。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV基因型分布 本組慢性乙型肝炎患者中B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%；未檢測到其他類型的基因型。

2.2 HBV P區耐藥基因檢測結果 本組慢性乙型肝炎患者中有61例檢測到耐藥基因突變，突變率為58.65%。在所檢測的10個突變位點中有9個位點檢測到突變：L180M、A181V/T、T184A/G/S/I/L/F、S202G/I、M204V/I、N236T、M250V/L/I、V173L、I169T；A194T位點未檢測到突變。HBV P區耐藥基因位點突變率情況見圖1，突變類型見表1。

圖1 HBV P區耐藥基因位點突變率情況

由圖1可見，HBV P區耐藥基因位點突變率最高的為M204V/I，其次為L180M，第3為A181V/T。

由表1可見，HBV P區耐藥基因發生單位點突變的有31例（50.82%），其中M204I突變類型最多；發生多位點突變的有30例（49.18%）；未檢測到L180M位點單突變，L180M突變伴隨M204V/I突變出現。

2.3 HBV基因型與HBV P區耐藥基因位點突變類型的關系 見表2。

由表2可見，HBV B基因型的患者與C基因型的患者P區耐藥基因突變率比較有統計學差異（P＜0.05），C基因型的患者高于B基因型的患者；其中C基因型的患者A181V/T位點突變率高于B基因型的患者（P＜0.05）。

3 討論

目前已發現HBV基因型有A～I 9種基因型，我國主要以B基因型和C基因型為主。HBV基因型分布具有明顯的地理差異，我國北方以C基因型為主，我國南方以B基因型為主[4-6]。本組104例慢性乙型肝炎患者中，B基因型有48例，占46.15%；C基因型有56例，占53.85%，未發現其他基因型。這說明金華地區HBV基因型以B型和C型為主，C基因型略高于B基因型。這可能與金華地區流動人口較多有關。馬幼麗等[7]的研究結果提示浙江HBV基因型以C基因型為主。

表1 HBV P區耐藥基因位點突變類型

表2 HBV基因型與HBVP區耐藥基因位點突變類型的關系[例（%）]

HBV P區位點的基因突變是HBV對NAs發生耐藥的重要原因之一。本研究結果顯示，在104例慢性乙型肝炎患者中，有61例患者發生了不同程度的HBV P區耐藥基因突變，突變率為58.65%。其中發生單位點突變有31例，多位點突變有30例。突變率最高的突變位點是M204V/I位點，突變率為73.85%，其次是L180M位點，但是L180M突變是伴隨M204V/I突變出現，未檢測到L180M單位點突變。這與文獻報道的結果相一致[8-9]。有研究指出L180M這個位點的伴隨性突變能夠增強HBV的復制能力，同時抵抗拉米夫定的病毒抑制作用[10]。本研究中HBV P區耐藥基因突變模式多樣，61例發生HBV P區耐藥基因突變的慢性乙型肝炎患者中，有30例（49.18%）患者發生多位點突變。這提示，金華地區慢性乙型肝炎的患者發生HBV P區耐藥基因突變率較高且易發生多位點耐藥基因突變；在發生A181V/T位點突變中，C基因型患者的突變率明顯高于B基因型。

《HBV耐藥專家共識：2009年更新》中指出拉米夫定常見耐藥相關變異為204I/V±rtLl80M，其中rtM204V多與rtL180M變異聯合出現，rtM204I變異可單獨出現。阿德福韋耐藥相關變異為rtN236T與rtA181V/T變異，2個位點變異可單獨或聯合出現。恩替卡韋相關變異是在rtM204V+rtL180M變異基礎上，聯合rtT184、rtS202或rtM250 3個位點中至少1個位點的氨基酸替代變異。替比夫定常見的耐藥相關位點為rtM204I[11]。本研究結果顯示，在所檢測到耐藥基因突變類型中以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見，占50.82%（31/61），這個結果與北京佑安醫院的研究結果相同[12]。這兩種突變類型是拉米夫定和替比夫定耐藥最易發生的類型，說明金華地區慢性乙型肝炎耐藥以拉米夫定和替比夫定為主。L180M+M204V+其他的耐藥基因突變類型占18.03%（11/61），說明金華地區發生恩替卡韋的耐藥率相對較高。因此采用基因測序技術檢測HBV P區耐藥基因突變對于抗病毒療效檢測和抗病毒方案的制定與調整有重要的意義。

綜上所述，本研究對金華地區HBV基因型分布特征和HBV P區耐藥基因突變位點類型進行初步探討，結果發現金華地區慢性乙型肝炎患者HBV基因型以B、C基因型為主；HBV P區耐藥基因位點突變類型多樣，以M204I和M204V/I+L180M兩種類型最常見；HBV C基因型的患者比B基因型的患者更易發生耐藥突變，且更易發生A181V/T位點突變。

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Genotypes and mutation patterns of HBV gene in chronic hepatitis B patients in Jinhua

LIU Ying,ZHU Yijun,WANG Yue. Department of Central Laboratory,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Chronic hepatitis B Resistance mutation Genotype Nucleoside analogues

2017-04-21）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-905

321000 金華市中心醫院中心實驗室

劉穎，E-mail：liuyingtj2008@sina.com

【 Abstract】 Objective To analyze genotypes and mutation patterns of HBVgene in chronic hepatitis B patients in Jinhua. Methods One hundred and four patients with chronic hepatitis B who were treated with nucleoside analogues,were enrolled in the study.Sanger sequence analysis of HBV genotypes and 10 common sites of HBV P region were performed. Results There were 46.15%cases of B genotype and 53.85%of C genotype among 104 chronic hepatitis B patients.Other genotypes were no detected.HBV P gene mutation were detected in 61 cases (58.65%);there was 65.57%in HBV C genotype and 34.43%in B genotype.M204V/I was the most common site of HBV P gene mutation (73.85%),followed by L180M (36.92%)and A181V/T (23.08%).50.82%cases had single site mutation and the most mutation pattern was M204I(29.51%);and 49.18%had multiple sites mutation;the most common mutation patterns were M204I and M204V/I+L180M.The resistance mutation rate in C genotype was higher than that in B genotype(71.43%vs 43.75%,P＜0.05)and the mutation rate of A181V/T in C genotype cases was higher than that in B genotype cases(14.29%vs 2.08%,P＜0.05). Conclusion Genotype B and C are the main genotypes of HBVin this study.The most common mutation patterns of HBVP gene were M204I and M204V/I+L180M.Genotype C patients had more mutations than genotype B and the A181V/T mutation pattern was more common in genotype C.