扶正解毒祛瘀方聯合奧沙利鉑對人結腸癌HT-29細胞增殖與凋亡的影響及機制研究Δ

趙秀梅，周 冰，張桂賢，柴仲秋，劉曉蕓，劉洪斌#(.天津市醫藥科學研究所，天津 30000;.天津市濱海新區中醫醫院肛腸科，天津 30045)

扶正解毒祛瘀方聯合奧沙利鉑對人結腸癌HT-29細胞增殖與凋亡的影響及機制研究Δ

趙秀梅1＊，周 冰2，張桂賢1，柴仲秋2，劉曉蕓2，劉洪斌1#(1.天津市醫藥科學研究所，天津 300020;2.天津市濱海新區中醫醫院肛腸科，天津 300451)

目的:研究扶正解毒祛瘀方(簡稱“扶正方”)聯合奧沙利鉑(L-OHP)對人結腸癌HT-29細胞增殖與凋亡的影響及機制。方法:將HT-29細胞分為空白對照組(不加藥物)、扶正方組(1 000mg/L)、L-OHP組(31.25mg/L)和聯合用藥組(1 000mg/L扶正方+31.25mg/L L-OHP)。加入相應藥物作用48 h后，采用MTT法檢測細胞增殖情況，倒置顯微鏡下觀察細胞形態的改變，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)法檢測細胞中促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表達，Western blot法檢測細胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達。結果:與空白對照組比較，L-OHP組和聯合用藥組細胞增殖均受到抑制、S期和G2/M期細胞比例升高、G0/G1期細胞比例降低(P＜0.05)，L-OHP組、扶正方組和聯合用藥組細胞凋亡率升高、細胞中BaxmRNA及蛋白的表達上調、細胞中Bcl-2mRNA的表達下調(P＜0.05)，且聯合用組變化較兩藥單用組更明顯(P＜0.05)。結論:扶正方與L-OHP聯合應用可抑制HT-29細胞的增殖、促進細胞凋亡，且作用優于兩藥單用;其機制可能與上調細胞中Bax基因與蛋白表達、下調細胞中Bcl-2基因表達有關。

扶正解毒祛瘀方;奧沙利鉑;人結腸癌HT-29細胞;增殖;凋亡;體外

奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)是繼順鉑、卡鉑后的第三代鉑類抗癌藥物，其通過產生烷化結合物作用于DNA，形成鏈內和鏈間交聯，從而抑制DNA的合成及復制。近年，含L-OHP在內的FOLFOX4方案被推薦為Ⅱ、Ⅲ期大腸癌患者的一線治療方案[1-2]。但是在使用L-OHP的過程中仍出現了化療藥物所共有的問題，如毒副作用大、患者耐受性差等。近年來，中醫藥治療已成為大腸癌綜合治療中重要的組成部分，尤其在增強大腸癌術后化療的抗腫瘤作用、減輕化療所致的毒副作用、輔助患者平穩度過化療階段、降低術后復發和轉移率、延長生存期等方面凸顯了其優勢[3-5]。本課題組成員在長期的臨床實踐中，以參苓白術散、桃紅四物湯和小承氣湯為基礎，以扶正解毒祛瘀為立法依據，組方后得到扶正解毒祛瘀方(簡稱“扶正方”)，針對大腸癌術后常見的氣虛毒瘀證型進行治療，結果發現扶正方在扶助體內正氣及增強化療藥物抗癌效果作用的同時，還有通腑瀉濁、減輕化療毒副作用的功效，前期的研究也證實了扶正方有協同增加L-OHP抗腫瘤的作用[6]，但其作用機制尚不明確。為此，本研究分別通過MTT法、流式細胞術、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)、Western blot等方法檢測扶正方聯合L-OHP對人結腸癌HT-29細胞的增殖、凋亡的影響及可能的相關機制，希望為大腸癌的中西醫結合綜合治療提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

FACSCantoⅡ型流式細胞儀(美國BD公司);Light-Cycler 480Ⅱ型qRT-PCR儀(瑞士Roche公司);Infinite M 200型酶聯免疫檢測儀(瑞士Tecan公司);IM型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 藥品與試劑

扶正方由太子參、慧苡仁、生槐花、知母、當歸、黃柏、桃仁、紅花等中藥按照一定比例組成，由天津市濱海新區中醫醫院提供，按照臨床用藥煎煮方法濃縮成每1 g含2.015 g生藥的浸膏，裝于密閉玻璃瓶中，4℃保存，批號為20150909，臨用時用含10%小牛血清的RPM I1640培養液制備成相應濃度的藥液。

注射用L-OHP(南京制藥廠有限公司，批號: 201411132，規格:50mg/瓶);MTT(美國Sigma公司);細胞周期、熒光素FITC標記的膜聯蛋白V(Annexin-V FITC)凋亡檢測試劑盒(天津三箭生物技術有限公司，批號:CY2001-O、AO2001-02P-G);兔源Bax、Bcl-2抗體(美國Santa Cruz公司);熒光定量試劑盒SYBR Green M ix(美國Roche公司);兔源β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國CST公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);引物由北京Invitrogen生物技術公司合成。

1.3 細胞株

人結腸癌HT-29細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

2 方法

2.1 細胞增殖抑制率測定

取對數生長期HT-29細胞，經0.25%胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，用含10%小牛血清的RPM I1640培養液調整細胞密度為1×105m L-1，接種于96孔板上，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h。然后將細胞隨機分為扶正方組(1 000mg/L)、L-OHP組(31.25 mg/L)和聯合用藥組(1 000 mg/L扶正方+31.25 mg/L L-OHP)，并另設不加藥物的空白對照組，每組設4個復孔。培養48 h后，小心棄去上清，每孔加入MTT溶液(0.5 g/L)100μL，繼續培養4 h后棄去上清，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150μL，用微量振蕩器振蕩10 m in使結晶物充分溶解。以酶標儀于570 nm波長下檢測每孔的光密度(OD)值，按下式計算細胞增殖抑制率:增殖抑制率(IR，%)=(1-給藥組OD值/空白對照組OD值)×100%。

2.2 細胞形態觀察

取對數生長期的HT-29細胞，調整成密度為1×105m L-1的細胞懸液，接種于25 cm2的培養瓶中，貼壁24 h后，按“2.1”項下分組、給藥。然后將細胞置于37℃、5% CO2飽和溫度培養箱中培養48 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態學變化。

2.3 細胞周期測定

收集“2.2”項下作用48 h的HT-29細胞，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，離心，收集細胞沉淀，然后用70%冰乙醇溶液，在4℃下固定細胞24 h，再用PBS洗滌2次后將細胞重懸于PBS中。加核糖核酸酶A(終質量濃度為50μg/m L)，于37℃水浴30m in，加入碘化丙啶(PI，終質量濃度為20μg/m L)，避光，室溫孵育15m in，流式細胞儀測定細胞周期情況。試驗重復3次。

2.4 細胞凋亡測定

收集“2.2”項下作用48 h的HT-29細胞，PBS洗2遍，將細胞重懸于試劑盒配套的1×結合緩沖液(Binding buffer)中，用Annexin V與PI染料避光孵育15m in，流式細胞儀測定細胞凋亡情況。試驗重復3次。

2.5 細胞中Bax、Bcl-2mRNA表達檢測

收集“2.2”項下作用48 h的HT-29細胞，根據RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄成cDNA，qRT-PCR擴增以檢測各組細胞中相關基因表達量。引物序列:β-actin，上游引物序列為5′-ATCAGCAAGCAGGAGTATG-3′，下游為5′-AATAAAGCCATGCCAATC-3′，擴增片段長度為105 bp;Bax，上游引物序列為5′-TCTGACGGCAACTTCAACTG-3′，下游為5′-AACCACCCTGGTCTTGGAT-3′，擴增片段長度為90 bp;Bcl-2，上游引物序列為5′-TGTTGTTCAAACGGGATTCA-3′，下游為5′-GAGCCAAGTGCAGCCACAATA-3′，擴增片段長度為120 bp。PCR反應步驟:95℃、5 m in;95℃、20 s，60℃、20 s，72℃、20 s，50個循環;72℃、5m in。總反應體系為25μL。采用公式2-ΔΔct計算各基因表達的相對表達水平，其中Δct為目的基因ct值-內參基因ct值。試驗重復3次。

2.6 細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達檢測

收集“2.2”項下作用48 h的HT-29細胞，按總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，每孔蛋白上樣20μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，加入一抗4℃孵育過夜，次日取出，置于洗膜容器中，TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗，于室溫下水平搖床上孵育1 h。避光條件下滴加發光液，反應1m in。將PVDF膜置于凝膠成像儀中，根據條帶的亮度設置適當的曝光時間進行曝光，保存圖片。將采集到的圖片用凝膠圖像處理系統分析條帶的灰度值，以目的蛋白與內參(β-actin)條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。試驗重復3次。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 細胞增殖抑制率測定結果

經扶正方、L-OHP或二者聯合作用48 h后，HT-29細胞的增殖均受到不同程度的抑制。與空白對照組比較，L-OHP組及聯合給藥組細胞OD值顯著降低(P＜0.05)，且聯合用藥組細胞OD值顯著低于扶正方組和L-OHP組(P＜0.05)，結果詳見表1。

表1 各組細胞IR測定結果(±s，n=4)Tab 1 Determ ination results of cell IR in each group (±s，n=4)

表1 各組細胞IR測定結果(±s，n=4)Tab 1 Determ ination results of cell IR in each group (±s，n=4)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與聯合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

IR，%組別空白對照組扶正方組L-OHP組聯合用藥組12.57±8.83 48.99±1.65 54.86±2.46 OD值0.736 7±0.040 1 0.644 1±0.053 1#0.3758±0.012 2＊#0.332 6±0.018 1＊

3.2 細胞形態觀察結果

空白對照組細胞狀態良好，胞質飽滿，相鄰細胞生長融合成片;扶正方組細胞生長形態較空白對照組無明顯變化;而L-OHP組和聯合用藥組細胞逐漸向圓形轉變，體積縮小，偽足回縮，細胞間隙增大、折光性變差，幾無片狀細胞生長區，細胞生長抑制明顯，尤以聯合用藥組細胞形態變化更為顯著，結果詳見圖1。

圖1 細胞形態觀察結果(×100)Fig 1 Observation results of m orphlolgic changes(× 100)

3.3 細胞周期分布檢測結果

與空白對照組比較，扶正方組G0/G1、S、G2/M期細胞比例無明顯變化(P＞0.05);而L-OHP組及聯合用藥組S、G2/M期細胞比例顯著升高(P＜0.05)，G0/G1期細胞比例顯著降低(P＜0.05)，細胞被阻滯在S期和G2/M期，結果詳見圖2、表2。

圖2 細胞周期分布圖Fig 2 Distribution chartof the cell cycle

表2 各組細胞周期與細胞凋亡率測定結果(±s，n= 3，%)Tab 2 Determ ination results of the cell cycle and apoptosis rate in each grou(p±s，n=3，%?)

表2 各組細胞周期與細胞凋亡率測定結果(±s，n= 3，%)Tab 2 Determ ination results of the cell cycle and apoptosis rate in each grou(p±s，n=3，%?)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與聯合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

細胞周期分布比例 細胞凋亡率2.7±0.1 11.5±1.8＊#19.2±1.8＊#28.0±1.2＊S組別空白對照組扶正方組L-OHP組聯合用藥組G0/G154.12±2.16 56.24±0.97#42.29±1.34＊40.06±2.65＊37.57±0.92 34.81±2.69#45.14±1.98＊44.57±1.48＊G2/M 8.32±1.24 8.96±1.72#12.58±0.64＊15.37±1.16＊

3.4 細胞凋亡測定結果

與空白對照組比較，扶正方組、L-OHP組及聯合用藥組細胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)，且聯合用藥組細胞凋亡率顯著高于扶正方組和L-OHP組(P＜0.05)，結果詳見表2。

3.5 細胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達測定結果

與空白對照組比較，扶正方組、L-OHP組及聯合用藥組細胞中Bax mRNA及蛋白表達增強(P＜0.05)，Bcl-2mRNA的表達減弱(P＜0.05)，且聯合用藥組變化程度較扶正方組和L-OHP組更明顯(P＜0.05);各給藥組細胞中Bcl-2蛋白表達均有所減弱，但差異無統計學意義(P＞0.05)，結果詳見圖3、表3。

4 討論

在前期體外試驗中筆者曾發現，將濃縮后的中藥復方加入到培養體系中，采用MTT法測定細胞增殖時，鏡下觀察到高濃度樣品孔生成的甲臜顆粒明顯少于低濃度孔，但其測定出的OD值常常與低濃度樣品孔的OD值相當，甚至超過低濃度孔，這說明濃度較高時，中藥本身的顏色會對試驗結果產生干擾。為此，筆者在本研究中將配制后的扶正方藥液經過0.22μm無菌濾膜過濾，在除菌的同時還去除了藥液中不溶性顆粒，從而改善了藥液的澄清度。此外，加入MTT試劑前，先將細胞上清棄去，再加入由PBS緩沖液配制的低濃度MTT(0.5 g/L)溶液100μL，又進一步減低了藥液本身對測定的影響，保證了試驗結果的可信度。

圖3 各組細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達的電泳圖Fig 3 Electrophoresis chart of Bax，Bcl-2 protein expressionsof cells in each group

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達測定結果(±s，n=3)Tab 3 Determ ination results of the Bax，Bcl-2m RNA and protein expressions of cells in each group (±s，n=3)

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2m RNA及蛋白表達測定結果(±s，n=3)Tab 3 Determ ination results of the Bax，Bcl-2m RNA and protein expressions of cells in each group (±s，n=3)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與聯合用藥組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.combination group，#P＜0.05

組別空白對照組扶正方組L-OHP組聯合用藥組Bax蛋白表達0.68±0.03 0.64±0.04 0.57±0.09 0.56±0.08 mRNA表達1.00±0.05 1.34±0.27＊#1.88±0.34＊#2.35±0.38＊蛋白表達0.91±0.02 1.04±0.03＊#1.34±0.04＊#1.69±0.11＊Bcl-2 mRNA表達1.00±0.06 0.70±0.16＊#0.48±0.05＊#0.35±0.10＊

前期實驗中，筆者測定了不同質量濃度的扶正方(390.63、781.25、1 562.5、3 125、6 250 mg/L)和L-OHP (3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125mg/L)作用48 h后對HT-29細胞增殖的影響，結果二者均呈濃度依賴性地抑制細胞生長。中西醫結合抗腫瘤治療是今后的發展方向之一，在術后輔助化療中顯示了“增效減毒”的優勢[7-8]。課題組成員在臨床實踐中明確發現，大腸癌患者術后化療期間以扶正方為輔助用藥，其化療副反應少，且身體狀況平穩，顯示了良好的效果。為此，在觀察扶正方與L-OHP合用后對HT-29細胞增殖的影響時，筆者選擇了對細胞增殖抑制率在30%以下的1 000、2 000mg/L兩個質量濃度進行考察，結果低、高質量濃度的扶正方與L-OHP合用均具有協同增效作用[6]。考慮到中藥本身對測定結果的干擾，故在本次試驗中選擇1 000mg/L的作用濃度。L-OHP劑量選擇的是其半數抑制濃度(IC50)附近的濃度(31.25mg/L)，因為當劑量過大時，與扶正方合用后，L-OHP本身的抑制率與合用的抑制率差別往往不會太大，不利于評價合用后的效果。

腫瘤的發生與多種癌基因的激活和抑癌基因的失活有關。Bcl-2家族是最重要的凋亡調控基因，包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，前者包括Bax、Bak、Bad等，后者有Bcl-2、Bcl-xl和M cl-1等，兩者的比例決定了細胞的命運。當接受到上游信號后，促凋亡蛋白(如Bax)表達發生改變，從胞質轉移到線粒體膜上與Bcl-2或Bcl-xl形成二聚體，改變線粒體膜的通透性，從而引起細胞色素C的釋放。細胞色素C再與凋亡蛋白酶活化因子1結合，激活半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)，進而通過級聯反應激活下游的Caspase-3，最終導致細胞凋亡[9-10]。本研究表明，L-OHP單用及與扶正方聯合作用于HT-29細胞后，均可明顯抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，上調細胞中BaxmRNA和蛋白表達，下調細胞中Bcl-2mRNA的表達，使細胞被阻滯在S和G2/M期，且兩藥聯合后作用更顯著。以上結果說明，扶正方和L-OHP聯合應用具有協同作用，這可能是通過抑制Bcl-2mRNA轉錄、促進Bax mRNA轉錄，進而抑制Bcl-2蛋白表達、促進Bax蛋白表達，最終抑制HT-29細胞增殖并誘導其凋亡。本研究結果顯示，扶正方和L-OHP聯合用藥具有合理性，為進一步完善大腸癌的聯合用藥方案提供了試驗依據。

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Study on the Effect and Its M echanism of Fuzheng Jiedu Quyu Formula Combined w ith Oxaliplatin on Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer HT-29 Cell

ZHAO Xiumei1，ZHOU Bing2，ZHANG Guixian1，CHAIZhongqiu2，LIU Xiaoyun2，LIU Hongbin1(1.Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China;2.Dept.of Anorectal，TCM Hospital of Tianjin Binhai New Area，Tianjin 300451，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of Fuzheng Jiedu Quyu formula(short for“Fuzheng formula”) combined w ith oxaliplatin(L-OHP)on human colon cancer HT-29 cell proliferation and apoptosis.METHODS:HT-29 cells were divided into blank control group(w ithout drugs)，Fuzheng formula group(1 000 mg/L)，L-OHP group(31.25 mg/L)and combination group(1 000 mg/L Fuzheng formula+31.25 mg/L L-OHP).A fter cultured w ith corresponding drug for 48 h，MTT method was used to detect the cell proliferation;the changes of cellularmorphology were observed by invertmicroscope;flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis rate.Proapoptotic gene Bax，apoptotic gene Bcl-2 mRNA expressions were determined by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method;Bax，Bcl-2 protein expressions were assayed by Western blot.RESULTS:Compared w ith blank control group，cell proliferation was inhibited in L-OHP group and combination group;cell proportion was increased in S stage，G2/M stage and decreased in G0/G1stage(P＜0.05).Cell apoptosis rate in L-OHP group，Fuzheng formula group and combination group was increased;Bax mRNA and protein expression were up-regulated，Bcl-2 mRNA expression was downregulated(P＜0.05);and combination group changed more obviously than the single drug groups(P＜0.05).CONCLUSIONS:Fuzheng formula combined w ith L-OHP can inhibit HT-29 cell proliferation and promote its apoptosis，show ing better effects than either of the two drugs alone.Themechanism may be associated w ith up-regulation of Bax gene and protein expressions and down-regulation of Bcl-2 gene expressions in cells.

Fuzheng Jiedu Quyu formula;Oxaliplatin;Human colon cancer HT-29 cell;Proliferation;Apoptosis;in vitro

R735;R979

A

1001-0408(2017)19-2613-04

2016-11-11

2017-02-24)

(編輯:林 靜)

天津市中醫藥管理局中醫中西醫結合科研課題(No. 13164);天津市濱海新區塘沽科技發展專項資金項目(No.2013MS05-03);天津市濱海新區衛生局一般扶持項目(No.2014BWKY014)

＊副研究員，碩士。研究方向:中藥藥理、腫瘤藥理。電話:022-27236112。E-mail:zxmm lg@eyou.com

#通信作者:研究員，碩士生導師，博士。研究方向:肝膽胰疾病。電話:022-27313851。E-mail:jtss@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.06