卡維地洛對瘦素誘導的人肝星狀細胞活化增殖的影響及機制研究Δ

穆 華，張 哲，梁傳棟，劉 娜(1.河北省人民醫院門診辦公室，石家莊 050051;.河北省人民醫院代謝病重點實驗點，石家莊 050051;.河北省人民醫院神經外二科，石家莊 050051;4.河北省人民醫院消化內二科，石家莊050051)

卡維地洛對瘦素誘導的人肝星狀細胞活化增殖的影響及機制研究Δ

穆 華1＊，張 哲2，梁傳棟3，劉 娜4#(1.河北省人民醫院門診辦公室，石家莊 050051;2.河北省人民醫院代謝病重點實驗點，石家莊 050051;3.河北省人民醫院神經外二科，石家莊 050051;4.河北省人民醫院消化內二科，石家莊050051)

目的:研究卡維地洛對瘦素誘導的LX2人肝星狀細胞(HSC-LX2)活化增殖的影響及機制。方法:取對數生長期的HSC-LX2細胞分為空白對照組、瘦素刺激組和卡維地洛低、中、高濃度組(5、10、20μmol/L)，除空白對照組外，其余各組均加入0.1 g/L的瘦素及相應濃度的卡維地洛作用24 h。采用MTT法檢測細胞的光密度(OD)值，計算細胞增殖抑制率;流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況;實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測細胞中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、基質金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、瘦素及瘦素受體mRNA表達;Western blot法檢測磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(p-STAT3)蛋白表達。結果:與空白對照組比較，瘦素刺激組細胞的OD值增加、凋亡率降低、G0/G1期細胞減少(P＜0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受體mRNA表達和p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均增強(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組細胞的OD值減小、凋亡率升高、細胞主要阻滯在G0/G1期(P＜0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受體mRNA表達和p-JAK2、p-STAT3蛋白表達均減弱(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。結論:卡維地洛能夠抑制瘦素誘導的HSC-LX2細胞的活化增殖，促進HSC-LX2細胞凋亡;其機制可能與下調瘦素、瘦素受體基因表達并阻斷瘦素誘導的細胞內JAK 2/STAT3信號通路激活有關。

卡維地洛;人肝星狀細胞;增殖;凋亡;瘦素;Janus激酶2;信號轉導和轉錄激活因子3

肝纖維化是各種原因引起的慢性肝病形成及發展的中間階段，其發病機制尚未完全闡明。目前認為，肝星狀細胞(Hepatic stellate cells，HSC)活化增殖在肝纖維化發病中起關鍵作用。而瘦素是導致肝纖維化的始動因子之一，其通過與HSC的瘦素受體結合能夠激活Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路，致使HSC活化增殖并抑制HSC凋亡[1-2]。HSC活化的主要標志物包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和基質金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)。因此，抑制HSC活化增殖、誘導HSC凋亡可能是治療肝纖維化的重要措施。卡維地洛是第3代β受體阻滯藥，具有良好的抗腎小球纖維化作用。本文通過研究卡維地洛對LX2人肝星狀細胞(HSC-LX2)活化增殖及瘦素誘導的JAK2/STAT3信號通路的影響，初步探討卡維地洛對肝纖維化的影響及作用機制。

1 材料

1.1 儀器

960酶標儀(美國Sigma公司);Chem iDocTMXRS+化學發光凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司);7300實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)儀(美國ABI公司);EPICSXL流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 藥品與試劑

重組瘦素(美國Protech公司，批號:8110060R，純度:≥98%);卡維地洛注射用粉末(齊魯制藥有限公司，批號:H20020547，規格:100mg/瓶);MTT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:C6628);膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡試劑盒(美國BD公司);碘化丙啶(PI)染液(廣州浩瑪生物科技有限公司);鼠源磷酸化JAK2(p-JAK2)、磷酸化STAT3 (p-STAT3)、β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京康為世紀生物科技有限公司);反轉錄反應體系、SYBR Green RT-PCR試劑盒、Trizol總RNA提取試劑盒(美國Promega公司)。

1.3 細胞

HSC-LX2細胞購自博慧斯生物醫藥科技有限公司，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、100 u/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素、4mmol/m L谷氨酰胺的RPM I1640培養液常規培養。

2 方法

2.1 分組與給藥

將HSC-LX2細胞培養至70%融合時，加入0.25%胰酶消化，以1∶3比例傳代。將處于對數生長期的HSC-LX2細胞以5×105m L-1密度接種于6孔板中。細胞分5組:空白對照組(加含10%胎牛血清的RPM I1640培養液)、瘦素刺激組[加含10%胎牛血清和瘦素(0.1 g/L)的RPM I1640培養液]和卡維地洛低、中、高濃度組[加含10%胎牛血清、瘦素(0.1 g/L)和相應濃度卡維地洛(5、10、20μmol/L)的RPM I1640培養液]，共培養24 h。

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率

取對數生長期的HSC-LX2細胞，消化、離心，以5× 105m L-1接種于96孔板中，每孔100μL。待細胞貼壁后棄培養液，按“2.1”項下方法分組、給藥，繼續培養24 h，每孔加入MTT 20μL，培養4 h后在酶標儀490 nm波長處測定各孔光密度(OD)值，重復3次，取均值，計算細胞增殖抑制率:細胞增殖抑制率(%)=(瘦素刺激孔平均OD值-給藥孔平均OD值)/瘦素刺激孔平均OD值× 100%。試驗重復8次。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期分布和凋亡情況

取對數生長期的HSC-LX2細胞，消化、離心，以1× 105個/孔接種于24孔板中，按“2.1”項下方法分組、給藥，給藥后培養24 h，0.25%胰酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，70%乙醇重懸細胞，4℃固定24 h。測定前30m in加入PI溶液，振蕩混勻，避光，流式細胞儀檢測細胞周期。測定前1 h加入標記熒光素FITC的Annexin V和PI染液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。試驗重復8次。

2.4 RT-PCR法檢測細胞中a-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受體mRNA表達

采用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進行反轉錄合成DNA，RT-PCR儀擴增，引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系:25μL;反應條件:93℃預變性5m in;93℃變性45 s，55℃退火1m in，72℃延伸45 s，40個循環。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴增的ct值，其中ct值是PCR產物的熒光達到檢測閾值時的擴增循環數。以β-actin為內參，按2-ΔΔct法計算目標基因的相對表達量。試驗重復8次。RT-PCR引物序列及產物長度見表1。

表1 RT-PCR引物序列及產物長度Tab 1 RT-PCR prim er sequencesand product length

2.5 Western blot法檢測細胞中p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達

提取細胞總蛋白，半干法電泳轉移至聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，依次加入特異性p-JAK2、p-STAT3多克隆抗體，4℃孵育過夜。洗膜后加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫下孵育2 h，洗膜，化學發光法顯色、定影。用UVP 7.0軟件掃描測定蛋白條帶積分光密度(IOD)值。以β-actin為內參，以目的蛋白與內參IOD值的比值表示目的蛋白的相對表達量。試驗重復8次。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 細胞增殖情況

與空白對照組比較，瘦素刺激組細胞的OD值明顯增加(P＜0.05)，卡維地洛各濃度組細胞的OD值明顯減小(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組細胞的OD值明顯減小(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。各組細胞增殖抑制率的測定結果見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率的測定結果(n=8)Tab 2 Determ ination results of cell inhibition rate in each group(n=8)

3.2 細胞周期分布和凋亡情況

與空白對照組比較，瘦素刺激組活細胞數及S期細胞比例明顯增加、凋亡率及G0/G1期細胞比例明顯降低(P＜0.05);卡維地洛各濃度組活細胞數及S期細胞比例明顯降低、凋亡率及G0/G1期細胞比例明顯增加(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組活細胞數及S期細胞比例明顯降低、凋亡率及G0/G1期細胞比例明顯增加(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。各組細胞凋亡的流式圖見圖1，細胞周期分布和凋亡率測定結果見表3。

3.3 細胞中活化標志物a-SMA、TIMP-1m RNA表達情況

與空白對照組比較，瘦素刺激組細胞中α-SMA、TIMP-1mRNA表達明顯增強(P＜0.05);卡維地洛各濃度組細胞中α-SMA、TIMP-1mRNA表達明顯減弱(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組細胞中α-SMA、TIMP-1mRNA表達明顯減弱(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。各組細胞中α-SMA、TIMP-1 mRNA表達的測定結果見表4。

3.4 細胞中瘦素、瘦素受體m RNA表達情況

與空白對照組比較，瘦素刺激組細胞中瘦素、瘦素受體mRNA表達明顯增強(P＜0.05);卡維地洛各濃度組細胞中瘦素、瘦素受體mRNA表達明顯減弱(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組細胞中瘦素、瘦素受體mRNA表達明顯減弱(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。各組細胞中瘦素、瘦素受體mRNA表達的測定結果見表4。

圖1 各組細胞凋亡的流式圖Fig 1 Flow graph of cellapoptosis in each group

表3 各組細胞細胞周期分布和凋亡率的測定結果(x± s，n=8)Tab 3 Determ ination results of cell cycle distribution and apoptosis rate in each grou(p±s，n=8)

表3 各組細胞細胞周期分布和凋亡率的測定結果(x± s，n=8)Tab 3 Determ ination results of cell cycle distribution and apoptosis rate in each grou(p±s，n=8)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與瘦素刺激組比較，#P＜0.05;與卡維地洛低濃度組比較，ΔP＜0.05;與卡維地洛中濃度組比較，□P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.leptin-stimulated group，#P＜0.05;vs.carvedilol low-concentration group，ΔP＜0.05;vs. carvedilolmedium-concentration group，□P＜0.05

組別空白對照組瘦素刺激組卡維地洛低濃度組卡維地洛中濃度組卡維地洛高濃度組G2/M期2.45±0.35 2.59±0.34 2.37±0.26 2.03±0.17 1.79±0.13活細胞數，個90.44±14.32 108.25±16.51＊76.56±12.61＊#61.14±9.56＊#△38.28±6.34＊#□凋亡率，% 2.69±0.42 1.01±0.15＊3.41±0.52＊#4.77±0.75＊#△6.43±0.89＊#□細胞比例，% G0/G1期46.32±7.31 40.16±6.22＊50.33±8.12＊#57.77±9.23＊#△63.08±9.43＊#□S期40.67±6.65 44.43±6.54＊39.13±6.62＊#36.25±5.12＊#△32.88±4.16＊#□

3.5 細胞中p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達情況

與空白對照組比較，瘦素刺激組細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯增強(P＜0.05);卡維地洛各濃度組細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯減弱(P＜0.05)。與瘦素刺激組比較，卡維地洛各濃度組細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯減弱(P＜0.05)，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。各組細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見表5。

表4 各組細胞中a-SMA、TIMP-1、瘦素和瘦素受體m RNA表達的測定結果(±s，n=8)Tab 4 Determ ination results of a-SMA，TIMP-1，leptin，leptin receptor m RNA expressions in cells in each grou(p±s，n=8)

表4 各組細胞中a-SMA、TIMP-1、瘦素和瘦素受體m RNA表達的測定結果(±s，n=8)Tab 4 Determ ination results of a-SMA，TIMP-1，leptin，leptin receptor m RNA expressions in cells in each grou(p±s，n=8)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與瘦素刺激組比較，#P＜0.05;與卡維地洛低濃度組比較，ΔP＜0.05;與卡維地洛中濃度組比較，□P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.leptin-stimulated group，#P＜0.05;vs.carvedilol low-concentration group，ΔP＜0.05;vs. carvedilolmedium-concentration group，□P＜0.05

組別空白對照組瘦素刺激組卡維地洛低濃度組卡維地洛中濃度組卡維地洛高濃度組瘦素受體0.98±0.15 1.07±0.16＊0.80±0.14＊#0.69±0.11＊#△0.52±0.08＊#□α-SMA 0.88±0.14 0.97±0.16＊0.73±0.12＊#0.65±0.10＊#△0.47±0.07＊#□TIMP-1 0.79±0.13 0.90±0.15＊0.67±0.11＊#0.54±0.09＊#△0.41±0.06＊#□瘦素1.13±0.16 1.23±0.18＊0.99±0.12＊#0.81±0.13＊#△0.65±0.09＊#□

圖2 各組細胞中p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cells in each group

表5 各組細胞中p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達的測定結果(±s，n=8)Tab 5 Determ ination results of p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cells in each group(x± s，n=8)

表5 各組細胞中p-JAK 2、p-STAT3蛋白表達的測定結果(±s，n=8)Tab 5 Determ ination results of p-JAK 2，p-STAT3 protein expressions in cells in each group(x± s，n=8)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與瘦素刺激組比較，#P＜0.05;與卡維地洛低濃度組比較，ΔP＜0.05;與卡維地洛中濃度組比較，□P＜0.05Note:vs.blank control group，＊P＜0.05;vs.leptin-stimulated group，#P＜0.05;vs.carvedilol low-concentration group，ΔP＜0.05;vs. carvedilolmedium-concentration group，□P＜0.05

組別空白對照組瘦素刺激組卡維地洛低濃度組卡維地洛中濃度組卡維地洛高濃度組p-STAT3蛋白0.84±0.14 0.98±0.16＊0.72±0.12＊#0.60±0.09＊#△0.45±0.07＊#□p-JAK2蛋白0.93±0.15 1.14±0.18＊0.81±0.14＊#0.69±0.11＊#△0.51±0.08＊#□

4 討論

在HSC轉化為肌成纖維細胞過程中，HSC活化增殖是肝纖維化的中心環節，活化的HSC大量表達α-SMA、TIMP-1及各種細胞外基質成分，最終導致肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭[3]。研究顯示，肥胖基因編碼產物瘦素通過促進HSC活化增殖參與肝臟纖維化的形成及發展。正常情況下，肝細胞不表達瘦素，但表達其受體;而在肝纖維化發生后，瘦素及瘦素受體表達隨著肝纖維化的嚴重程度增加而增強[4]。瘦素與瘦素受體結合后通過激活JAK2/STAT3信號通路而發揮其生物學功能[5]。因此，下調瘦素及瘦素受體表達或阻斷JAK2/STAT3信號通路對于延緩或逆轉肝纖維化具有重要意義。近年來，多項研究表明，交感神經系統過度激活與肝損傷后的修復和纖維化進程密切相關，而交感神經系統阻滯劑能夠明顯抑制肝纖維化進程[6]。筆者前期研究發現，HSC能夠合成和釋放去甲腎上腺素，并表達α1、β1、β2等亞型腎上腺素受體，且其表達水平隨著肝纖維化進展而增強[7]。此外，筆者進一步發現去甲腎上腺素能夠上調體外活化的大鼠HSC瘦素及瘦素受體表達，并通過腎上腺素α、β2受體對HSC發揮促增殖和抑凋亡作用，這可能是交感神經系統促進肝纖維化進程的機制之一[8]。

卡維地洛是新一代β受體阻滯藥，具有阻滯腎上腺素α1、β1、β2受體，抗炎，抗氧化，抑制平滑肌細胞增殖的作用[9]。臨床研究表明，卡維地洛能夠明顯降低門脈壓力，可作為預防肝硬化門脈高壓消化道出血的首選藥物[10]。另外，Ding Q等[11]研究表明，卡維地洛能夠抑制血管生成，從而抑制肝纖維化進程。然而，卡維地洛的抗肝纖維化作用是否涉及瘦素機制目前尚未見報道。為此，筆者選擇HSC-LX2細胞為研究對象，旨在觀察卡維地洛對HSC-LX2細胞活化增殖、凋亡及瘦素誘導JAK2/ STAT3信號通路激活的影響。本研究結果表明，卡維地洛通過阻斷瘦素誘導的JAK2/STAT3信號通路的激活，可抑制HSC-LX2細胞活化增殖、促進其凋亡。

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[8]劉娜，穆華，梁傳棟，等.去甲腎上腺素對肝星狀細胞表達瘦素以及瘦素受體的影響[J].世界華人消化雜志，2015，23(7):1052-1058.

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[11]Ding Q，Tian XG，LiY，etal.Carvedilolmay attenuate liver cirrhosis by inhibiting angiogenesis through the VEGFSrc-ERK signaling pathway[J].World J Gastroenterol，2015，21(32):9566-9576.

Study on the Effect and Its M echanism of Carvedilol on Leptin-induced Activation and Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells

MU Hua1，ZHANG Zhe2，LIANG Chuandong3，LIU Na4(1.Outpatient Office，Hebei People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China;2.Key Laboratory of Metabolites，Hebei People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China;3.SurgicalWard 2，Dept.of Neurosurgery，Hebei People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China;4.Medical Ward 2，Dept.of Gastroenterology，Hebei People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of carvedilol on leptin-induced activation and proliferation of LX2 human hepatic stellate cells(HSC-LX2).METHODS:HSC-LX2 w ith logarithmic grow th periodswere divided into blank control group，leptin-stimulated group and carvedilol low-concentration，medium-concentration，high-concentration groups(5，10，20 μmol/L).Except for the blank control group，other groups were added 0.1 g/L leptin and corresponding concentration of carvedilol. A fter 24 h，MTTmethod was used to detect the optical density(OD)value of cells and calculate the proliferation rate.Flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis.Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reactionmethod was used to detect theα-smooth muscle actin(α-SMA)，matrix metalloproteinase inhibition factor 1(TIMP-1)，leptin，leptin receptor mRNA expressions.Western blotmethod was used to detect phosphorylated Janus kinase 2(p-JAK2)，phosphorylated signal transduction and transcriptional activator 3(p-STAT3)protein expressions.RESULTS:Compared w ith blank control group，OD value of cell was increased in leptin-stimulated group;apoptotic rate was decreased;cells of G0/G1were decreased;α-SMA，TIMP-1，leptin，leptin receptor mRNA expressions and p-JAK2，p-STAT3 protein expressions were increased(P＜0.05).Compared w ith leptin-stimulated group，OD values of cells were decreased in carvedilol concentration groups;apoptotic rate was increased，and the cells were mainly blocked in G0/G1phase;α-SMA，TIMP-1，leptin，leptin receptormRNA expressions and p-JAK2，p-STAT3 protein expressions were decreased(P＜0.05)and was concentration-depended(P＜0.05).CONCLUSIONS:Carvedilol can inhibit the activation and proliferation of leptin-induced HSC-LX2，promote its apoptosis.Themechanism may associate w ith down-regulating leptin，leptin receptor gene expression and blocking JAK2/STAT3 signal pathway activation by leptin in cells.

Carvedilol;Human hepatic stellate cells;Proliferation;Apoptosis;Leptin;Janus kinase 2;Signal transduction and transcriptional activator 3

R361+.3

A

1001-0408(2017)19-2620-05

2016-10-13

2016-11-29)

(編輯:鄒麗娟)

河北省醫學科學研究重點課題計劃項目(No. ZL20140250)

＊主治醫師，碩士。研究方向:慢性肝病。電話:0311-85988343。E-mail:mh8375@126.com

#通信作者:主治醫師，博士。研究方向:慢性肝病。電話:0311-85988543。E-mail:1093961170@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.08