螺旋藻激酶對動脈粥樣硬化模型大鼠血管內皮功能的影響Δ

何秋璟，王慧杰，龐 輝#，楊 瑩，黃媛恒，黃澤裕，江夢鳳，華媛媛，農秀紅，張康玲(1.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東東莞 53808;.廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 53001)

螺旋藻激酶對動脈粥樣硬化模型大鼠血管內皮功能的影響Δ

何秋璟1，2＊，王慧杰2，龐 輝2#，楊 瑩2，黃媛恒2，黃澤裕2，江夢鳳2，華媛媛2，農秀紅2，張康玲2(1.廣東醫科大學基礎醫學院，廣東東莞 523808;2.廣西醫科大學基礎醫學院，南寧 530021)

目的:研究螺旋藻激酶(SPK)對動脈粥樣硬化模型大鼠血管內皮功能的影響。方法:將60只大鼠隨機分為正常對照組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、陽性對照組(辛伐他汀，0.005 g/kg)和SPK低、中、高劑量組(80、160、320 U/kg)。除正常對照組外，其余各組大鼠均復制動脈粥樣硬化模型;同時，各組大鼠ig相應藥物，每天1次，連續給藥12周。測定大鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量;蘇木精-伊紅染色觀察大鼠胸主動脈血管內膜的形態改變。結果:與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、IL-6和TNF-α含量增加(P＜0.01)，HDL-C含量降低(P＜0.01);血管內皮細胞脫落，內膜增生、向管腔內突起，平滑肌細胞增殖且排列紊亂，中膜彈力纖維崩解斷裂。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、IL-6和TNF-α含量下降(P＜0.05或P＜0.01)，陽性對照組和SPK中、高劑量組大鼠血清中HDL-C含量增加(P＜0.05);給藥組大鼠血管內皮細胞形態較模型組明顯改善，其中SPK中、高劑量組大鼠血管內皮細胞各層結構完整、內膜基本光滑，SPK中劑量組大鼠血管中膜平滑肌細胞排列稍紊亂，與正常對照組比較無明顯變化。結論:SPK有明顯的降脂和抗炎作用，可保護血管內皮功能;其作用機制可能與降低血清中TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α含量和升高血清中HDL-C含量有關。

螺旋藻激酶;動脈粥樣硬化;白細胞介素6;腫瘤壞死因子α;血管內皮;大鼠

螺旋藻(Spirulina)是一種原核生物，在水中生存，具有豐富的營養價值，富含蛋白質、氨基酸、維生素、多糖、γ-亞麻酸等。螺旋藻經過發酵酶化后可產生螺旋藻激酶(Spirulina kinase，SPK)，SPK是一種絲氨酸蛋白酶，耐熱、耐堿，具有直接降解纖維蛋白[1]、可延長大鼠血液凝固時間、溶解大鼠血栓的作用，同時對體外培養的過氧化損傷模型和腎上腺素損傷模型的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)具有保護作用，可提高HUVEC細胞活性、降低其通透性[2]。SPK的作用機制是通過增加HUVEC分泌組織型纖溶酶原激活物t-PA的含量，減少纖溶酶原激活物抑制劑1的釋放，使內皮細胞表面纖溶活性升高，增強抗血栓作用[2-5]。內皮細胞的功能除與血液的抗凝、溶栓作用有關外，還與血管的功能有密切聯系。本研究通過復制大鼠動脈粥樣硬化模型，觀察不同劑量SPK對動脈粥樣硬化模型大鼠血脂、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量以及動脈血管形態學的影響，探討SPK保護內皮細胞、抗動脈粥樣硬化的作用及作用機制，為將其開發為抗動脈粥樣硬化藥物提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

BA 400數碼三目攝像光學顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司);TGL-16A低溫離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);7100全自動生化儀(日本日立公司)。

1.2 藥品與試劑

辛伐他汀片(涿州東樂制藥有限公司，批號:10C14-0907，規格:20mg/片);維生素D3膠囊(上海通用藥業股份有限公司，批號:121203，規格:1m L∶7.5mg∶30萬單位);大鼠IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號:L29015724、L29015724);螺旋藻發酵物粉劑(廣西北?？蹈９?，批號:152871，用時提純);其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，♂，體質量200～230 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:桂動許字(2000)第001號。

2 方法

2.1 SPK的制備

取螺旋藻發酵物粉劑20 g，低溫離心(4℃，離心半徑:9 cm，3 000 r/m in，下同)10min后棄去沉淀，加入三蒸水，在層析冷柜中攪拌均勻，4℃下靜置過夜后，離心10m in。收集上清液，硫酸銨分級鹽析收集沉淀，透析，凍干，凝膠層析，凍干保存備用，得到SPK比活(活力單位數/毫克蛋白)為2 631U/mg[1]。

2.2 分組、造模與給藥

將60只大鼠隨機分為正常對照組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、陽性對照組(辛伐他汀，0.005 g/kg，給藥劑量為人體等效劑量)和SPK低、中、高劑量組(80、160、320 U/kg，給藥劑量依據預實驗確定，為有效劑量)，每組10只。除正常對照組外的其余各組大鼠給予高脂飼料喂養(高脂飼料配方:3%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.9%膽酸鈉、10%豬油、5%白糖、80.9%基礎飼料)[6]，并于第1～3天ip維生素D3200 000 u/kg，于第15、36、57天ip維生素D3100 000 u/kg;正常對照組大鼠給予普通飼料喂養，并在上述對應時間ip 2m L注射用油[7]。造模開始時，正常對照組、模型組大鼠每天ig蒸餾水2m L，各給藥組大鼠ig相應藥物，每日1次，連續給藥12周。

2.3 取材

各組大鼠于給藥第12周后，ip 20%氨基甲酸乙酯麻醉，腹主動脈取血。血樣在常溫(25℃)靜置30m in后，離心10min，取血清分裝冷凍(-80℃)保存。取升主動脈根部起始段至腹主動脈分叉處的胸主動脈血管，生理鹽水沖洗，10%中性甲醛固定，室溫(25℃)放置，待檢。

2.4 檢測項目及方法

采用全自動生化儀測定大鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。采用ELISA法測定大鼠血清中IL-6、TNF-α含量，嚴格按照試劑盒規定操作。將固定后的胸主動脈血管脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，采用光學顯微鏡觀察血管內膜形態。

2.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對所得數據進行分析。計量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，若方差齊則使用LSD檢驗進行兩兩比較，若不齊則采用Games-Howell檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量測定結果

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量增加(P＜0.01)，HDL-C含量降低(P＜0.01);與模型組比較，除SPK低劑量組大鼠血清中HDL-C含量變化不顯著外，其余各給藥組大鼠上述血清指標均顯著改善(P＜0.05或P＜0.01)，結果見表1。

表1 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量測定結果(±s，n=10，mmol/m L)Tab 1 Results of TC，TG，LDL-C，HDL-C contents in serum of rats in each group(±s，n=10，mmol/m L)

表1 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量測定結果(±s，n=10，mmol/m L)Tab 1 Results of TC，TG，LDL-C，HDL-C contents in serum of rats in each group(±s，n=10，mmol/m L)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

HDL-C 1.47±0.22 1.20±0.17＊＊1.46±0.12#1.19±0.19 1.39±0.25#1.65±0.05#組別正常對照組模型組陽性對照組SPK低劑量組SPK中劑量組SPK高劑量組TC 2.18±0.16 3.17±0.09＊＊1.62±0.12##2.78±0.15##2.75±0.19##2.28±0.23##TG 0.94±0.18 1.23±0.17＊＊0.36±0.06##0.62±0.10##0.39±0.06##0.64±0.08##LDL-C 0.21±0.06 1.89±0.16＊＊0.52±0.10##1.25±0.14##1.07±0.14##0.87±0.14##

3.2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量測定結果

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量增加(P＜0.01);與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均減少(P＜0.05或P＜0.01)，結果見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量測定結果(x± s，n=10，pg/m L)Tab 2 Results of IL-6，TNF-αcontents in serum of rats in each grou(p±s，n=10，pg/m L)

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量測定結果(x± s，n=10，pg/m L)Tab 2 Results of IL-6，TNF-αcontents in serum of rats in each grou(p±s，n=10，pg/m L)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α 17.49±0.81 24.64±0.92＊＊17.82±0.61##19.42±0.56##18.31±1.80##15.52±0.92##組別正常對照組模型組陽性對照組SPK低劑量組SPK中劑量組SPK高劑量組IL-6 56.52±2.86 83.25±4.56＊＊45.45±1.72##76.45±2.60#60.52±2.38##48.82±1.49##

3.3 各組大鼠胸主動脈血管內膜形態學觀察結果

正常對照組大鼠血管各層結構完整，內膜光滑，中膜彈力纖維正常;與正常對照組比較，模型組大鼠血管內皮細胞脫落，內膜增生、向管腔內凸起，平滑肌細胞增殖且排列紊亂，中膜彈力纖維崩解斷裂;SPK低劑量組大鼠尚見血管內膜脫落，內膜增生、向管腔內凸起;SPK中劑量組大鼠血管內膜光滑，中膜平滑肌細胞排列稍紊亂;陽性對照組和SPK高劑量組大鼠血管內膜各層結構完整，內膜光滑，中膜彈力纖維正常，結果見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈內膜形態學觀察結果(HE，×400)Fig 1 M orphological observations of thoracic aortic intmamorphology of rats in each group(HE，× 400)

4 討論

本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL-C含量升高，血管壁出現硬化改變，表明動脈粥樣硬化模型復制成功[6-7]。動脈粥樣硬化的發病機制復雜、表現形式多樣，血脂代謝異常是其重要病因之一。血脂代謝異常包括TC、LDL-C、TG含量的升高和HDL-C含量的降低。血清中TC和LDL-C含量的異常升高是發生動脈粥樣硬化的危險信號。與LDL-C的作用相反，HDL-C是一種重要的抗氧化物質，具有將肝外組織的膽固醇轉運到肝，減少超氧陰離子生成，從而保護內皮細胞的作用，起到抗動脈粥樣硬化的作用。當LDL-C含量升高時，可向動脈內膜遷移，然后被內膜細胞產生的氧化自由基氧化修飾成氧化的LDL-C，導致脂質和脂肪酸的沉淀，引起巨噬細胞內膽固醇的聚集和泡沫細胞的形成，引發內皮細胞功能障礙，這是動脈粥樣硬化形成的重要病理機制[8-10]。辛伐他汀能顯著降低血清中TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，是目前臨床應用效果最明確的改善血脂代謝紊亂、改善內皮功能、延緩動脈粥樣硬化進程的藥物[11-12]，故本研究以其為陽性對照。結果，與模型組比較，陽性對照組和SPK各劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均下降，陽性對照組和SPK中、高劑量組大鼠血清中HDL-C含量顯著上升，表明SPK也具有改善血脂代謝紊亂的作用，并由此抑制動脈粥樣硬化的形成。

研究表明，動脈粥樣硬化是血管受損后發生的一種炎癥反應過程，炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化發生和發展的整個階段。IL-6是在多種刺激下產生的多功效細胞因子，可調節炎癥反應過程。IL-6水平長期升高可促進動脈粥樣硬化的發生[13]。TNF是一類具有多種生物學活性的細胞因子，共包括3種，其中TNF-α主要由單核-巨噬細胞產生。動脈粥樣硬化發生時，血清中的TNF-α含量顯著上升[14]，其可通過誘導細胞壞死、促進新生血管和血栓形成而誘導動脈粥樣硬化的發生，是病理變化過程中引發內膜增生與內皮功能紊亂的重要炎癥因子之一[15]。本研究結果顯示，與模型組比較，陽性對照組與SPK各劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均下降，說明辛伐他汀和SPK均可有效降低動脈粥樣硬化大鼠血清中IL-6、TNF-α的釋放。

綜上所述，SPK能保護血管內皮結構完整，減輕炎癥反應，對動脈粥樣硬化的發生有一定的預防作用，其作用機制可能與降低血清中TC、TG、LDL-C、IL-6和TNF-α含量，升高血清中HDL-C含量有關。

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Effects of Spiru lina K inase on Vascular Endothelial Function of M odel Ratsw ith Atherosclerosis

HE Qiujing1，2，WANG Huijie2，PANG Hui2，YANG Ying2，HUANG Yuanheng2，HUANG Zeyu2，JIANG Mengfeng2，HUA Yuanyuan2，NONG Xiuhong2，ZHANG Kangling2(1.Basic Medical College，Guangdong Medical University，Guangdong Dongguan 523808，China;2.Basic Medical College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

OBJECTIVE:To study the effects of spirulina kinase(SPK)on the vascular endothelial function ofmodel rats w ith atherosclerosis.METHODS:60 rats were random ly divided into normal control group(distilled water)，model group(distilled water)，positive control group(simvastatin，0.005 g/kg)and SPK low-dose，medium-dose，high-dose groups(80，160，320 U/kg). Except for normal control group，rats in other groupswere induced formodel of atherosclerosis.A ll groupswere intragastrically adm inistrated relevantmedicines at the same time，once a day for consecutive 12 weeks.Total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)，low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)，high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)，interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)contents in serum of rats weremeasured.And the changes of thoracic aortic endothelium morphology were observed by HE staining.RESULTS:Compared w ith normal control group，TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-αcontents in serum of rats in model group were increased(P＜0.01)，HDL-C content in serum was decreased(P＜0.01);vascular endothelial cells fell off，intimal proliferation projected into the lumen，smooth muscle cell proliferated and disordered，medium film elastic fiber disintegrated and fractured.Compared w ith model group，TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-αcontents in serum of rats in adm inistration groups were decreased(P＜0.05 or P＜0.01)，HDL-C content in positive control group and SPK medium-dose，high-dose groupswas increased(P＜0.05).Vascular endothelial cellmorphology was improved significantly in administration groups，in which，vascular endothelial cells were structurally intact in SPK medium-dose，high-dose groups，inner membrane was basically smooth;medium smooth muscle cells arranged slightly disordered in SPK medium-dose group.Compared w ith normal control group，there were no obvious changes.CONCLUSIONS:SPK shows obvious lipid-lowering and anti-inflammatory effects，it can protect vascular endothelial function.Themechanism may be related to reducing TC，TG，LDL-C，HDL-C，IL-6，TNF-αcontents and increasing HDL-C content in serum.

Spirulina kinase;Atherosclerosis;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-α;Vascular endothelium;Rats

R965.1

A

1001-0408(2017)19-2628-04

2017-01-24

2017-05-24)

(編輯:劉明偉)

廣西自然科學基金資助項目(No.2013GXNSFAA019176，2014GXNSFBA118156)

＊實驗師，碩士。研究方向:海洋藥物、心血管保護機制。電話: 0771-5358074。E-mail:765260567@qq.com

#通信作者:教授，碩士生導師。研究方向:海洋藥物及心血管保護機制。電話:0771-5358074。E-mail:454720524@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.10