神經酸對帕金森病模型小鼠運動障礙的緩解作用及機制研究

鄭 輝，孫作乾，王志亮，魏正風，馮 炎，張興柱，王付蒼，史永強，高肇林#(.棗莊科技職業學院醫學技術系，山東滕州 77500;.山東益康藥業股份有限公司山東省晶型藥物重點實驗室，山東滕州 7753)

神經酸對帕金森病模型小鼠運動障礙的緩解作用及機制研究

鄭 輝1，2＊，孫作乾1，王志亮1，魏正風2，馮 炎2，張興柱2，王付蒼2，史永強2，高肇林2#(1.棗莊科技職業學院醫學技術系，山東滕州 277500;2.山東益康藥業股份有限公司山東省晶型藥物重點實驗室，山東滕州 277513)

目的:研究神經酸對帕金森病(PD)模型小鼠運動障礙的緩解作用及機制。方法:將小鼠隨機分為空白對照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、多巴絲肼片組(陽性對照，按左旋多巴計120mg/kg)和神經酸低、中、高劑量組(20.0、40.0、80.0mg/kg)，每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠均建立PD模型。成模后，每天ig相應藥物1次，連續14 d。末次給藥后，觀察各組小鼠行為學變化，采用高效液相色譜法測定小鼠腦紋狀體內多巴胺(DA)及其代謝物二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量。結果:與空白對照組比較，模型組小鼠爬桿時間延長、滾筒時間縮短、自發運動次數減少(P＜0.05)，腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量均降低(P＜0.05)。與模型組比較，多巴絲肼片組和神經酸各劑量組小鼠爬桿時間縮短、滾筒時間延長(P＜0.05)，腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量均升高(P＜0.05);多巴絲肼片組和神經酸高劑量組小鼠自發運動次數增加(P＜0.05)。結論:神經酸可有效改善PD模型小鼠的運動障礙癥狀，其機制可能與增加腦紋狀體內DA含量有關。

神經酸;帕金森病;小鼠;運動障礙;多巴胺

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)為一種常見的神經系統退行性疾病，臨床表現為靜止震顫、肌肉強直、自發運動障礙等癥狀，患者生活自理能力較差。中國現有PD患者約170萬人，并保持每年約6%的增長速度[1]。中樞擬膽堿藥左旋多巴目前為治療PD的公認藥物，但這種藥物長期服用后的不良反應較大，制約了其在臨床上的使用。所以，尋找新的藥物是目前PD研究領域的熱點。

神經酸(Nervonic acid)為一種具有24個碳原子的單不飽和脂肪酸，最先是從哺乳類動物腦神經內分離出來的，室溫條件下為白色片狀結晶性固體。神經酸作為腦神經細胞中的一種核心神經營養因子，能夠修復受損的神經元末梢、促進神經細胞生長發育和提高腦神經活躍程度，是腦細胞生長所必需的營養物質[2]。研究證明，神經酸具有增強免疫功能[3]、防治艾滋病、防治惡性腫瘤、治療阿爾茨海默病[4]、治療齊薇格綜合征[5]等作用，但未見其在治療帕金森病方面的應用。本文研究神經酸對模型小鼠PD的緩解作用及機制，為其開發及臨床使用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Alliance2695液相色譜儀、2475熒光檢測器(美國Waters公司);TGL-20M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)。

1.2 藥品與試劑

神經酸(上海恒棵生物科技有限公司，批號:151011，純度:90.0%);多巴絲肼片(商品名:美多芭，上海羅氏公司，批號:SH2443，規格:每片含左旋多巴200mg、芐絲肼50mg);1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、多巴胺(DA)、二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)等均購自美國Sigma公司。

1.3 動物

C57BL/6小鼠，SPF級，♀♂各半，8周齡，體質量(20±2)g，由山東大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(魯)2009-0001。

2 方法

2.1 樣品的制備

神經酸按每100 g加入30m L聚山梨酯80的比例混合研磨，加純化水制成白色均勻乳液，用時以純化水配制成所需濃度即可。

2.2 分組與給藥

將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、多巴絲肼片組(陽性對照，按左旋多巴計120mg/kg)[6]和神經酸低、中、高劑量組(20.0、40.0、80.0mg/kg，給藥劑量在參考文獻[7]及前期預實驗結果的基礎上確定)。除空白對照組外，其余各組小鼠ip生理鹽水溶解的MPTP溶液25 mg/kg，每天1次，連續5 d。選取步長變短、活動減少、運動緩慢、全身震顫、豎毛豎尾等行為改變的小鼠作為合格PD模型小鼠，每組10只，♀♂各半。5 d后，各給藥組小鼠ig相應藥物0.2m L/10 g，空白對照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續14 d。末次給藥24 h后，進行行為學實驗。

2.3 行為學實驗

2.3.1 爬桿實驗 將一個圓形小球(直徑3 cm)固定于一根竹桿(長50 cm，直徑1 cm)的頂部，竹桿表面纏繞多層紗布以免打滑。夾住小鼠尾尖，鼠頭朝下放在桿頂，并保證其雙后肢落在小球表面，然后使其順著竹桿順勢爬下。自小鼠適應環境4 d后開始計時，從附在桿頂頭朝下開始，到雙前肢接觸小桿底端結束，記錄小鼠爬桿時間。

2.3.2 滾筒實驗 將小鼠放在滾筒儀的表面上，調整儀器旋轉速度為35 r/m in。自小鼠適應環境4 d后開始計時，小鼠站在筒上滾筒旋轉開始，到從滾筒上掉落結束，記錄小鼠在滾筒上的持續時間。

2.3.3 自發運動實驗 參考文獻[8]進行實驗。把小鼠放在自發運動儀中心，確保環境安寧不嘈雜。打開自發運動監測儀，使紅外線自由穿過，當小鼠活動時可阻擋紅外線，自小鼠適應環境2m in后開始計時，記錄5min內小鼠運動次數。

2.4 腦紋狀體內DA及其代謝產物DOPAC、HVA含量的測定

[9]測定各組小鼠腦紋狀體內DA及其代謝產物DOPAC、HVA含量。

2.4.1 色譜條件色譜柱:ZORBAX SB C18(250mm× 4.6 mm，5μm);流動相:(0.02 mol/L枸櫞酸鈉-0.05 mol/L磷酸氫二鈉)-甲醇(95∶5);流速:1.0m L/min;柱溫:35℃;發射波長:285 nm，激發波長:333 nm;進樣量: 20μL。

2.4.2 線性關系 分別精密稱取DA、DOPAC、HVA適量，用流動相稀釋制成300、50、50μg/m L的貯備液。精密量取各貯備液適量，按需要用流動相稀釋成系列質量濃度，按“2.4.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積。以藥物質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行回歸分析。

2.4.3 準確度、基質效應、精密度 按相關方法操作考察本方法的準確度、基質效應和精密度。

2.4.4 測定方法 行為學實驗完成后，小鼠剪頭取腦放在冰盤表面并迅速剝離出紋狀體，稱質量后置于2m L EP管內，準確加入0.1mol/L冰冷高氯酸溶液1.0m L，在冰浴條件下超聲(5 kHz，30 s)使細胞壁破損，4℃下10 000 r/min(離心半徑為10 cm)離心30min，取上清液進樣測定。

2.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。數據用±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 行為學考察結果

與空白對照組比較，模型組小鼠的爬桿時間明顯延長，滾筒持續時間明顯縮短，自發運動次數明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠的爬桿時間均明顯縮短，滾筒持續時間均明顯延長(P＜0.05);多巴絲肼片組和神經酸高劑量組小鼠的自發運動次數明顯增加(P＜0.05)。各組小鼠行為學考察相關指標測定結果見表1。

3.2 含量測定結果

本文色譜條件下，其他輔料均不干擾DA、DOPAC和HVA的測定，其日內精密度試驗的含量RSD分別為5.4%～11.4%、4.9%～12.6%、5.1%～11.9(n=5)，日間精密度試驗的含量RSD分別為7.1%～10.1%、10.8%～12.4%、11.8%～13.1(n=3);準確度分別為99.6%～106.6%、99.8%～111.0%、99.4%～108.0%(n=3);基質效應分別為86.9%～105.3%、91.7%～102.8%、94.5%～102.1%。DA、DOPAC和HVA的線性關系見表2。

表1 各組小鼠行為學考察相關指標測定結果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

表1 各組小鼠行為學考察相關指標測定結果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

組別空白對照組模型組多巴絲肼片組神經酸低劑量組神經酸中劑量組神經酸高劑量組滾筒持續時間，s 601±21.55 256±14.89＊421±18.66#314±16.08#367±15.99#388±17.05#爬桿時間，s 6.21±1.52 36.66±5.08＊8.62±1.14#11.59±1.23#10.01±1.11#9.83±1.03#自發運動次數96.5±17.9 70.8±16.8＊92.8±17.2#79.7±16.7 84.6±17.6 89.8±17.4#

表2 DA、DOPAC和HVA的線性關系Tab 2 Linear relationshipsof DA，DOPAC and HVA

3.3 腦紋狀體內DA、DOPAC和HVA含量測定結果

與空白對照組比較，模型組小鼠腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量明顯增加(P＜0.05)。各組小鼠腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量的測定結果見表3。

表3 各組小鼠腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量的測定結果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

表3 各組小鼠腦紋狀體內DA、DOPAC、HVA含量的測定結果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

組別空白對照組模型組多巴絲肼片組神經酸低劑量組神經酸中劑量組神經酸高劑量組HVA 0.83±0.10 0.16±0.03＊0.71±0.09#0.37±0.06#0.46±0.08#0.60±0.07#DA 5.66±0.83 0.48±0.03＊4.18±0.94#1.09±0.27#1.75±0.43#2.41±0.38#DOPAC 0.99±0.17 0.17±0.06＊0.89±0.15#0.50±0.14#0.62±0.24#0.76±0.06#

4 討論

PD的發病機制相對復雜，目前認為其病理變化部位為中腦部黑質-紋狀體DA能神經元。由于DA是抑制運動行為的關鍵性神經遞質，而乙酰膽堿(Ach)則是興奮運動行為的關鍵性神經遞質，故黑質-紋狀體DA能神經元發生退行性改變，導致DA濃度顯著下降，致使膽堿能神經功能相對亢進，從而出現PD癥狀。當DA含量降低至50%以下時，會導致紋狀體內DA和Ach平衡嚴重失調，產生靜止震顫、肌肉強直、自發運動障礙等PD癥狀。目前，臨床上常用藥物進行治療，作用機制為使紋狀體內DA和Ach重新達到平衡，從而緩解PD癥狀[10]。

MPTP作為一種常用的造模用特殊神經毒物，其脂溶性高，易經血液循環穿過血腦屏障進入腦內，能損傷DA能神經元。本實驗采用MPTP誘發小鼠PD模型，結果顯示，PD模型小鼠自發活動較少，啃食東西及整理皮毛動作明顯減少，攀爬行為減少，有的小鼠甚至出現啃食艱難、體質量降低、姿勢協調功能較差等。此外，模型小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較正常小鼠明顯降低，這些現象與現有PD模型報道[11-13]一致。因此，本實驗建立的小鼠PD模型科學可靠。

本研究結果顯示，PD模型小鼠ig神經酸后，其爬桿時間縮短，滾筒持續時間延長，自發活動次數增加，說明神經酸能提高PD模型小鼠的活動平衡及運動協調能力，可有效改善PD模型小鼠運動遲緩和肌肉強直等運動功能障礙癥狀。DOPAC和HVA為DA代謝產物，腦內DOPAC和HVA的含量能間接反映DA含量的高低。本研究結果顯示，模型組小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較空白對照組明顯降低，而神經酸各劑量組和多巴絲肼片組小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較模型組明顯增加，說明神經酸緩解PD模型小鼠運動功能障礙癥狀的機制可能與增加腦紋狀體內DA含量有關。

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(編輯:鄒麗娟)

Study on the A lleviation Effect and Its M echanism of Nervonic Acid on M ovement Disorder of M odel M ice w ith Parkinson’s Disease

ZHENG Hui1，2，SUN Zuoqian1，WANG Zhiliang1，WEI Zhengfeng2，FENG Yan2，ZHANG Xingzhu2，WANG Fucang2，SHIYongqiang2，GAO Zhaolin2(1.Dept.of Medical Technology，Zaozhuang Vocational College of Science &Technology，Shandong Tengzhou 277500，China;2.Shandong Province Key Laboratory of Polymorph Drugs，Shandong Yikang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shandong Tengzhou 277513，China)

OBJECTIVE:To study the alleviation effect of nervonic acid on movement disorder ofmodelmice w ith Parkinson’s disease(PD).METHODS:M ice were random ly divided into blank control group(normal suline)，model group(normal saline)，Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group(positive control，calculated by L-dopam ine 120 mg/kg)，nervonic acid low-dose，medium-dose，high-dose groups(20.0，40.0，80.0 mg/kg)，10 in each group.Except for blank control group，m ice in other groups were inducced for PD models.After modeling，m ice were intragastrically given relevantmedicines，once a day，for 14 d.After the last administration，behavioral changes ofm ice in each group were observed.HPLC was conducted to detect dopam ine(DA)and itsmetabolites dihydroxybenzoic acid(DOPAC)，homovanillic acid(HVA)concentrations in the striatum ofm ice. RESULTS:Compared w ith blank control group，climbing time was extended in model group，drum time was shortened，spontaneous movement times was decreased，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were reduced(P＜0.05).Compared w ith model group，climbing time was shortened in Levodopa and benserazide hydrochlo ride tablet group，nervonic acid dose groups，drum time was extended，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were increased(P＜0.05);and spontaneousmovement times was increased in Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group，and nervonic acid high-dose group(P＜0.05).CONCLUSIONS:Nervonic acid can effectively improve symptoms of movement dysfunction of modelmice w ith PD.The mechanism may associate w ith increasing DA content in the striatum.

Nervonic acid;Parkinson’s disease;M ice;Movement disorder;Dopam ine

R965

A

1001-0408(2017)19-2648-04

2016-10-24

2016-12-09)

＊講師，碩士。研究方向:新藥開發。電話:0632-5953070。E-mail:zhenghui198334@163.com

#通信作者:高級工程師，博士。研究方向:新藥開發。電話: 0632-5953070。E-mail:sdykyy@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.16