右美托咪定對膿毒癥小鼠炎癥反應的影響及機制研究

郭 茂，王文明(瀘州市人民醫院麻醉科，四川瀘州 646000)

右美托咪定對膿毒癥小鼠炎癥反應的影響及機制研究

郭 茂＊，王文明(瀘州市人民醫院麻醉科，四川瀘州 646000)

目的:研究右美托咪定(Dex)對膿毒癥小鼠炎癥反應的影響及機制。方法:將小鼠隨機分為正常對照組、模型組、微小RNA-146a(m iR-146a)抑制劑(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)組和Dex低、中、高劑量組(10、30、50μg/kg)，每組10只。除正常對照組外，其余各組小鼠ip脂多糖建立膿毒癥模型，0.5 h后ip相應藥物。藥物干預6 h后，實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測各組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達及其靶基因白細胞介素1(IL-1)受體相關激酶(IRAK1)、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子6 (TRAF6)mRNA表達，Western blot法檢測外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6蛋白的表達，酶聯免疫吸附法檢測血清中TNF-α、IL-6的水平。結果:與正常對照組比較，模型組小鼠的m iR-146a表達增強，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6mRNA和蛋白表達增強(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達增強，TNF-α、IL-6水平下降，IRAK1、TRAF6蛋白表達減弱(P＜0.05或P＜0.01)，但IRAK1、TRAF6 mRNA表達變化不明顯(P＞0.05)。與Dex高劑量組比較，m iR-146a抑制劑+Dex組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達減弱，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6蛋白表達增強(P＜0.05或P＜0.01)，但IRAK1、TRAF6mRNA表達變化不明顯(P＞0.05)。結論:Dex可抑制膿毒癥小鼠炎癥反應，其機制可能與誘導m iR-146a表達、抑制Toll樣受體4/核因子κB通路中的兩個重要接頭蛋白IRAKI和TRAF6的表達有關。

膿毒癥;右美托咪定;m iR-146a;炎癥反應;小鼠;Toll樣受體4/核因子κB

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，病死率高，常發生于嚴重創傷、燒傷、外科手術后。機體受感染因素刺激后激活體內炎癥反應細胞，產生并釋放大量炎性介質，其相互作用并級聯放大，引起炎癥反應失控導致膿毒癥的發生。目前關于膿毒癥的治療策略有待深入研究，而闡明與膿毒癥密切相關的抗炎因子及其調控機制，無疑有助于膿毒癥的有效防治。微小RNA(m icroRNA，miR)是一系列單鏈非編碼RNA，通過使mRNA降解或抑制其翻譯調控基因表達，密切參與機體諸多生理、病理過程。研究顯示，m iR-146a與膿毒癥密切相關，可通過調控重要的炎癥Toll樣受體4/核因子κB(TLR-4/NF-κB)信號通路發揮抗炎作用[1-2]。右美托咪定(Dexmedetom idine，Dex)系一種高效的α2腎上腺素受體激動藥，是臨床上應用廣泛的麻醉輔助藥，具有鎮靜、鎮痛和抗焦慮等作用[3-4]。有研究發現，Dex有良好的抗炎、抗氧化效應，可發揮潛在的器官保護作用[5-6]，那么，Dex的抗炎作用是否與調節m iR-146a相關？本文通過脂多糖(LPS)誘導的小鼠膿毒癥模型，研究Dex對膿毒癥小鼠外周血單核細胞中miR-146a表達及其靶基因白細胞介素1(IL-1)受體相關激酶(IRAK1)、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子6(TRAF6)mRNA和蛋白表達，以及血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響，進一步探討Dex對膿毒癥小鼠炎癥反應的影響及機制。

1 材料

1.1 儀器

TJ-6低溫離心機(美國Beckman公司);7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀(美國ABI公司); H1MF酶標儀(美國Bio-Tek公司);ChemiDoc Touch Western blot檢測分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸Dex注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號:09081232，規格:200μg∶2m L);LPS(美國Sigma公司，批號:MFCD00164401，來源于大腸埃希菌O55∶B5，純度:90%);m iR-146a抑制劑(上海吉瑪制藥技術有限公司，批號:B03001，純度:99%);Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen公司);RIPA細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);兔抗IRAK1、TRAF6多克隆抗體(英國Abcam公司);兔抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(美國CST公司);辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司); m iRNA qRT-PCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司);Ficoll-Paque PREM IUM細胞分離液(瑞典GE公司);熒光定量試劑盒Universal SYBR Green Master(德國Roche公司);TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司)。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠60只，♂，體質量18～22 g，均購自原瀘州醫學院實驗動物中心，使用許可證號:SYXK (川)2013-065。

2 方法

2.1 模型的建立

[7]方法，采用ip LPS建立小鼠膿毒癥模型，LPS注射劑量為20mg/kg。小鼠注射LPS后出現寒戰、呼吸頻率加快、活動力降低、毛發聳立、解稀水樣糞便等癥狀即為膿毒癥模型建立成功。

2.2 分組與給藥

將60只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、m iR-146a抑制劑(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)組[8]和Dex低、中、高劑量組(10、30、50μg/kg)[9]，每組10只。除正常對照組小鼠ip生理鹽水0.2m L外，其余各組小鼠ip LPS建立膿毒癥模型;0.5 h后ip相應藥物，其中m iR-146a抑制劑ip給藥2 h后ip Dex。

2.3 qRT-PCR法檢測m iR-146a的表達

給藥6 h后，摘除各組小鼠眼球取血，分離外周血單核細胞，提取細胞總RNA，以小核RNA U6(snRNA U6)為內參，qRT-PCR法檢測m iR-146a的表達。m iR-146a上游引物為5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游通用引物由miRNA qRT-PCR試劑盒提供，擴增長度為100 bp;snRNA U6上游引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游引物為5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′，擴增長度為120 bp。擴增條件: 95℃預變性5min;95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環。以循環閾值(ct值)為統計參數，采用2-ΔΔct法計算相對表達量。

2.4 Western blot法檢測IRAK 1、TRAF6蛋白的表達

將小鼠外周血單核細胞經含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，4℃下12 000×g離心5m in，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，轉入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。將膜分別置于兔抗IRAK1、TRAF6、β-actin多克隆抗體稀釋液(稀釋比例均為1∶1 000)中，4℃孵育過夜，用PBST(含聚山梨酯20的磷酸鹽緩沖液)洗膜3次，每次10m in;再將膜置于HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中(稀釋比例為1∶10 000)，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10m in。將增強化學發光(ECL)底物滴加至PVDF膜上，通過Western blot檢測分析儀收集熒光信號，應用Quantity One軟件分析蛋白的灰度值，計算相對表達量。

2.5 qRT-PCR法檢測IRAK 1、TRAF6m RNA的表達

根據Trizol總DNA提取試劑說明書提取小鼠外周血單核細胞總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit將所得RNA反轉錄為cDNA，以β-actin為內參進行RTPCR檢測IRAK1、TRAF6 mRNA的表達。引物序列: β-actin上游引物為5′-GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3′，下游引物為5′-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3′，擴增長度為125 bp;IRAK1上游引物為5′-CCAACATTCCTTGCTTGCCC-3′，下游引物為5′-TCTCTTGTATACCTGTTCCTGGG-3′，擴增長度為108 bp;TRAF6上游引物為5′-TGAAGGAGAGAATCAGAGCAAG-3′，下游引物為5′-GCCACACAGCAGTCACTTTC-3′，擴增長度為121 bp。擴增條件:95℃預變性5m in;95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。以循環閾值(ct值)為統計參數，采用2-ΔΔct法計算相對表達量。

2.6 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6水平

采用ELISA法檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書要求操作。

2.7 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達情況

正常對照組、模型組、m iR-146a抑制劑+Dex組和Dex低、中、高劑量組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a相對表達量分別為1.06±0.11、3.36±0.25、4.43±0.45、3.60±0.21、5.46±0.39、8.67±0.46(n=10)。與正常對照組比較，模型組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達增強(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細胞中miR-146a表達增強(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠外周血單核細胞中m iR-146a表達增強(P＜0.01)。

3.2 小鼠外周血單核細胞中IRAK 1、TRAF6m RNA及蛋白表達情況

與正常對照組比較，模型組小鼠外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達增強(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6蛋白表達減弱(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6蛋白表達減弱(P＜0.01)。與模型組比較，m iR-146a抑制劑+Dex組和Dex各劑量組小鼠外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6mRNA表達差異均無統計學意義(P＞0.05)。各組小鼠外周血單核細胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達的測定結果見表1。

表1 各組小鼠外周血單核細胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表達的測定結果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

表1 各組小鼠外周血單核細胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表達的測定結果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與miR-146a抑制劑+Dex組比較，ΔΔP＜0.01Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.m iR-146a inhibitor+Dex group，ΔΔP＜0.01

TRAF6組別mRNA相對表達量IRAK1TRAF6蛋白相對表達量IRAK1 1.29±0.30 3.40±0.66＊＊3.26±0.56 3.22±0.67 2.79±0.56#2.08±0.58##△△正常對照組模型組miR-146a抑制劑+Dex組Dex低劑量組Dex中劑量組Dex高劑量組1.07±0.13 3.75±0.42＊＊3.97±0.38 3.66±0.45 3.55±0.41 3.54±0.43 1.08±0.15 4.24±0.46＊＊4.41±0.51 4.01±0.42 3.96±0.67 3.88±0.48 1.81±0.68 3.93±0.55＊＊3.50±0.47 3.79±0.21 3.29±0.49#2.30±0.46##△△

3.3 小鼠血清中TNF-α、IL-6水平變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平升高(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05)。各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結果見表2。

4 討論

炎癥因子的適度釋放是機體對抗外界刺激、發揮自身免疫功能所必需的，但是過度的炎癥反應會形成炎癥“瀑布”反應，則易導致膿毒癥的發生。重要的促炎因子TNF-α主要由單核-巨噬細胞產生，是炎癥反應中釋放最早的重要內源性炎癥因子之一，可直接損傷血管內皮細胞，并刺激IL-6等炎癥因子產生。IL-6也是重要的促炎因子，是反映組織損傷程度的早期敏感性指標。有效抑制炎癥因子的釋放是膿毒癥治療的重要策略。目前的研究發現，Dex可通過抗交感、抑制細胞炎癥和凋亡、抑制氧化應激反應、激活細胞保護信號通路等多種途徑對機體多臟器如腦、心、肺和腎發揮潛在的器官保護效應[10]，但Dex的抗炎機制仍需要深入研究。本研究結果表明，Dex可降低膿毒癥小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平，減弱其炎癥反應。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與m iR-146a抑制劑+Dex組比較，ΔP＜0.05Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.miR-146a inhibitor+dexmedetomidine group，ΔP＜0.05

組別正常對照組模型組miR-146a抑制劑+Dex組Dex低劑量組Dex中劑量組Dex高劑量組IL-6，pg/mL 20.06±3.59 141.15±17.49＊＊105.55±11.93 129.55±22.89 83.97±14.44#40.42±6.10##△TNF-α，pg/mL 35.33±4.04 580.86±35.13＊＊327.06±16.82 562.24±33.44 480.17±40.97#199.97±20.90##△

TLR4/NF-κB信號通路可促使大量炎癥介質的產生釋放，是誘導膿毒癥發生的重要信號通路。LPS與TLR4結合并活化TLR4，與髓樣分化蛋白88結合，進一步活化IRAK1、TRAF6，最后活化NF-κB抑制蛋白IκB激酶并降解IκB，使NF-κB激活，發生核轉位，啟動炎癥基因轉錄及翻譯。

研究顯示，m iR-146a的表達在膿毒癥患者中顯著增強，可作為潛在的判斷膿毒癥預后的指標[11]。miR-146a的靶基因是TLR4/NF-κB通路中的兩個重要接頭蛋白IRAK1和TRAF6，m iR-146a通過抑制IRAK1和TRAF6蛋白的表達，負性調控TLR4/NF-κB通路，抑制炎癥反應[12]。本研究發現，Dex可增強膿毒癥小鼠外周血單核細胞中miR-146a表達，并相應地抑制m iR-146a靶基因——炎癥信號TLR4/NF-κB通路中重要的接頭蛋白IRAK1和TRAF6的表達;同時，抑制miR-146a活性后，Dex的抗炎效應顯著減弱，提示Dex的抗炎活性部分由誘導抗炎分子m iR-146a介導。

綜上所述，Dex可通過誘導m iR-146a表達，下調IRAK1和TRAF6的表達，進而負性調控TLR4/NF-κB通路，并抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，從而在膿毒癥小鼠中發揮重要的抗炎效應，揭示了Dex抗炎作用的新機制。

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(編輯:鄒麗娟)

Study on the Effect and Its M echanism of Dexmedetom idine on the Inflammatory Response in Septic M ice

GUO Mao，WANG Wenm ing(Dept.of Anesthesiology，Luzhou People’s Hospital，Sichuan Luzhou 646000，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of dexmedetomidine(Dex)on inflammatory response in septic m ice.METHODS:M ice were random ly divided into normal control group，model group，m iR-146a inhibitor(50 mg/kg)+Dex (50μg/kg)group，Dex low-dose，medium-dose，high-dose groups(10，30，50μg/kg)，10 in each group.Except for normal control group，other groups were intraperitoneally injected lipopolysaccharide to induce septic models，intraperitoneally injected relevantmedicines after 0.5 h.A fter drug intervention for 6 h，m iR-146a expression，IRAK1 and TRAF6 mRNA expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method. IRAK1，TRAF6 protein expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by Western blot method. TNF-α，IL-6 levels in serum were detected by enzyme-linked immunosorbentmethod.RESULTS:Compared w ith normal control group，m iR-146a expression，TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 mRNA and protein expressions in peripheral blood mononuclear cells inmodel group were increased(P＜0.01).Compared w ithmodel group，miR-146a expression in peripheral blood mono-nuclear cells in Dex medium-dose，high-dose groups were increased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were decreased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).Compared w ith Dex high-dose group，miR-146a expression，in peripheral blood mononuclear cells in miR-146a inhibitor+Dex group was decreased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were increased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).CONCLUSIONS:Dex can inhibit the inflammatory response in septic m ice.Themechanism may associate w ith inducing m iR-146a expression and inhibiting the 2 important adaptor proteins IRAK1，TRAF6 expressions in Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway.

Sepsis;Dexmedetomidine;miR-146a;Inflammatory response;M ice;Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB

R971+.2

A

1001-0408(2017)19-2651-04

2016-12-22

2017-03-10)

＊主治醫師。研究方向:臨床麻醉。電話:0830-2361931。E-mail:guomaolzyxy@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.17