桉檸蒎腸溶軟膠囊對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的改善作用

李 璇，楊玉梅(1.武漢科技大學天佑醫院腎病科，武漢 430064;2.武漢科技大學天佑醫院呼吸內科，武漢430064)

桉檸蒎腸溶軟膠囊對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的改善作用

李 璇1＊，楊玉梅2#(1.武漢科技大學天佑醫院腎病科，武漢 430064;2.武漢科技大學天佑醫院呼吸內科，武漢430064)

目的:研究桉檸蒎腸溶軟膠囊對脂多糖(LPS)誘導小鼠急性肺損傷(ALI)的改善作用。方法:將60只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組和桉檸蒎腸溶軟膠囊低、中、高劑量組(100、300、900mg/kg)，每組12只。給藥組小鼠ig相應藥物，空白對照組和模型對照組小鼠ig等體積生理鹽水(0.1m L/10 g)。給藥2 h后，除空白對照組外，其余各組小鼠均采用LPS霧化吸入的方法誘導ALI模型。造模6 h后，處死小鼠取肺泡灌洗液(BALF)和肺組織，鏡下觀察肺組織形態學變化;血細胞計數板計算BALF中總細胞數和瑞氏-吉姆薩染色后計算BALF中中性粒細胞數;二喹啉甲酸法檢測BALF上清液中總蛋白濃度;酶聯免疫吸附法檢測BALF上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)含量。結果:與空白對照組比較，模型對照組小鼠肺組織發生明顯病理學損傷，肺水腫嚴重;BALF中總細胞數、中性粒細胞數和BALF上清液中總蛋白濃度以及TNF-α、IL-6含量均顯著增加(P＜0.01)。與模型對照組比較，桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組小鼠肺組織病理損傷明顯改善，BALF中總細胞數、中性粒細胞數和BALF上清液中總蛋白濃度以及TNF-α、IL-6含量均顯著減少(P＜0.05);其余各組差異無統計學意義(P＞0.05)。結論:高劑量桉檸蒎腸溶軟膠囊能明顯改善LPS誘導的小鼠ALI。

桉檸蒎腸溶軟膠囊;急性肺損傷;脂多糖;小鼠;改善作用

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是一種以炎癥、肺通透性增加和肺功能下降為特征的綜合征，其病因及發病機制復雜。研究表明，各種炎癥因子和趨化因子介導的復雜網絡調控在啟動、放大和促進ALI的病理過程中發揮了重要作用[1]。流行病學資料表明，ALI的臨床病死率高達30%～50%，然而到目前為止，臨床上尚無安全、有效的治療藥物[1-2]。開發相應藥物勢在必行。

桉檸蒎腸溶軟膠囊是由桃金娘科桉屬和蕓香科桔屬及松科松屬植物的提取物所組成，主要成分為桉油精、檸檬烯及α-蒎烯，臨床上廣泛用于急、慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴張、肺膿腫、慢性阻塞性肺部疾病等的治療[3]。近期臨床和基礎研究結果顯示，桉檸蒎腸溶軟膠囊具有較強的抗炎活性[3-4]，又考慮到該藥本身對肺部炎癥疾病具有較好的臨床療效，故在本研究中，筆者以霧化吸入脂多糖(LPS)的方法誘導小鼠發生ALI[5-6]，觀察桉檸蒎腸溶軟膠囊對模型小鼠ALI的改善作用，為該藥臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

550多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司);NB-150U超聲霧化器(日本歐姆龍公司);SZ61光學顯微鏡(日本Olympus公司);RC5B高速低溫離心機(美國Sorvall公司);血細胞計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

桉檸蒎腸溶軟膠囊(北京九和藥業有限公司，批號: 20161033，規格:300mg/粒);大腸埃希菌LPS(美國Sigma公司，批號:113M 4068V，規格:100mg/瓶);白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(深圳市達科為生物技術有限公司，批號: DKW 12-2060-096、DKW 12-2720-096);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號:E162-01)。

1.3 動物

健康Babl/c小鼠60只，♂，體質量18～20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號:SCXK(粵)2013-0002。實驗前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將60只小鼠隨機分為5組，每組12只，分別為空白對照組(生理鹽水)、模型對照組(生理鹽水)和桉檸蒎腸溶軟膠囊低、中、高劑量組(100、300、900mg/kg，給藥劑量根據預實驗結果而定)，ig給藥，0.1m L/10 g。在給藥2 h后，參考文獻[6]中方法，將模型對照組和桉檸蒎腸溶軟膠囊各劑量組小鼠置于20 cm×30 cm×40 cm的密閉箱中，霧化吸入LPS溶液(1mg/m L)30m in，誘導小鼠ALI;正常對照組小鼠霧化吸入生理鹽水。小鼠在霧化完成6 h后處死。

2.2 肺組織病理學檢測

每組隨機抽取6只小鼠，取左上肺舌葉，用10%中性甲醛固定24 h，常規脫水、石蠟包埋、切片后，蘇木精-伊紅(HE)染色。在光學顯微鏡下觀察小鼠肺泡間隔病變、炎癥細胞浸潤、血管瘀血狀況等肺組織病理學變化。

2.3 肺泡灌洗及灌洗液中細胞計數

每組取剩余6只小鼠，暴露氣管，用1.5m L磷酸鹽緩沖液(PBS)進行肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液(BALF)約1.35m L。取其中0.1m L，使用血細胞計數板進行總細胞計數。剩余BALF在低溫環境下離心(1 000×g)3 m in，取上清液分裝后置于4℃冰箱中保存(用于總蛋白定量和炎癥細胞因子檢測);再取細胞沉淀涂片，晾干后瑞氏-吉姆薩染色，在光學顯微鏡下觀察200個細胞，對中性粒細胞分類計算，最終得出BALF中中性粒細胞的數量。

2.4 BALF上清液中總蛋白濃度及TNF-α、IL-6含量檢測

從4℃冰箱中取出各組小鼠的BALF上清液，采用BCA法檢測其中總蛋白濃度，采用ELISA法檢測其中TNF-α、IL-6含量，具體操作按照相應試劑盒說明書進行。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 肺組織病理學變化觀察結果

空白對照組小鼠肺組織結構完整，肺泡間隔適中、無水腫、炎癥，肺泡腔清晰;模型對照組小鼠肺泡間隔增寬、肺泡壁破壞、肺間質水腫、部分肺泡融合，腔內可見滲出、水腫及出血，肺間質炎癥細胞浸潤;桉檸蒎腸溶軟膠囊各劑量組小鼠肺組織上述病理變化均明顯改善，肺泡壁破壞減少、出血及滲出情況減輕，結果詳見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化觀察結果(HE，×100)Fig 1 Observation results of pathological changes of lung tissue ofm ice in each group(HE，×100)

3.2 BALF中總細胞數和中性粒細胞數的檢測結果

與空白對照組比較，其余各組小鼠BALF中總細胞數和中性粒細胞數均顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較，桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組小鼠BALF中總細胞數和中性粒細胞數均顯著減少(P＜0.05)，桉檸蒎腸溶軟膠囊低、中劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)，結果詳見表1。

表1 各組小鼠BALF中總細胞數和中性粒細胞數的檢測結果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of number of total cells and neutrophils in BALF ofm ice in each group (±s，n=6)

表1 各組小鼠BALF中總細胞數和中性粒細胞數的檢測結果(±s，n=6)Tab 1 Determ ination results of number of total cells and neutrophils in BALF ofm ice in each group (±s，n=6)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊＊P＜0.01;vs.model control group，#P＜0.05

中性粒細胞數，×106mL-10.008±0.006 0.809±0.244＊＊0.829±0.207＊＊0.668±0.381＊＊0.338±0.239＊＊#組別空白對照組模型對照組桉檸蒎腸溶軟膠囊低劑量組桉檸蒎腸溶軟膠囊中劑量組桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組總細胞數，×106mL-10.030±0.016 0.918±0.316＊＊0.979±0.218＊＊0.773±0.430＊＊0.408±0.254＊＊#

3.3 BALF上清液中總蛋白濃度的檢測結果

與空白對照組比較，其余各組小鼠BALF上清液中總蛋白濃度均顯著升高(P＜0.01);與模型對照組比較，桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組小鼠BALF上清液中總蛋白濃度顯著降低(P＜0.05)，桉檸蒎腸溶軟膠囊低、中劑量組小鼠BALF上清液中總蛋白濃度差異無統計學意義(P＞0.05)，結果詳見表2。

表2 各組小鼠BALF上清液中總蛋白濃度以及TNF-α、IL-6含量的檢測結果(±s，n=6)Tab 2 Determ ination results of total protein concentration and TNF-α，IL-6 contents in BALF supernatantofm ice in each grou(p±s，n=6)

表2 各組小鼠BALF上清液中總蛋白濃度以及TNF-α、IL-6含量的檢測結果(±s，n=6)Tab 2 Determ ination results of total protein concentration and TNF-α，IL-6 contents in BALF supernatantofm ice in each grou(p±s，n=6)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，#P＜0.05Note:vs.blank control group，＊＊P＜0.01;vs.model control group，#P＜0.05

組別空白對照組模型對照組桉檸蒎腸溶軟膠囊低劑量組桉檸蒎腸溶軟膠囊中劑量組桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組IL-6，ng/mL 0.016±0.005 0.972±0.187＊＊0.874±0.213＊＊0.739±0.309＊＊0.385±0.124＊＊#總蛋白，mg/mL 0.134±0.021 0.349±0.058＊＊0.312±0.075＊＊0.299±0.119＊＊0.229±0.081＊＊#TNF-α，ng/mL 0.025±0.012 5.155±1.256＊＊4.751±1.672＊＊4.464±1.393＊＊2.469±0.909＊＊#

3.4 BALF上清液中TNF-α、IL-6含量的檢測結果

與空白對照組比較，其余各組小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著增加(P＜0.01);與模型對照組比較，桉檸蒎腸溶軟膠囊高劑量組小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著減少(P＜0.05)，桉檸蒎腸溶軟膠囊低、中劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)，結果詳見表2。

4 討論

過度及失控的炎癥反應是ALI發病的關鍵因素，其中最主要表現為肺內中性粒細胞聚集激活，以及肺內炎癥細胞因子的大量釋放。在ALI發病時，中性粒細胞被激活后產生和釋放遠超機體清除能力的大量自由基，并釋放彈性蛋白酶等損傷性酶，對肺泡上皮細胞、內皮細胞等造成氧化損傷[7]。同時，TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子介導的級聯“瀑布”反應進一步擴大了炎癥損傷。許多臨床和基礎研究均報道，肺部中性粒細胞的減少預示著肺損傷的良好預后[7-8]，而TNF-α、IL-6等細胞因子的水平則可能作為評估急性肺損傷嚴重程度的重要指標[9]。在本研究中，筆者觀察到高劑量桉檸蒎腸溶軟膠囊可顯著抑制LPS誘導的ALI模型小鼠肺部炎癥細胞的浸潤，以及炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的釋放，提示抑制肺部炎性反應是桉檸蒎腸溶軟膠囊發揮ALI改善作用的重要機制。

ALI的一個主要臨床表現為頑固性的低氧血癥，這是因為肺部過度炎癥損傷引起了肺微血管內皮細胞壁通透性的增加，毛細血管向肺組織滲出大量的蛋白內容物淤積于肺泡中，破壞了氣血屏障的換氣功能[10]。在本研究中，LPS的霧化吸入引起小鼠BALF上清液中總蛋白濃度顯著增高，提示小鼠造模成功，而高劑量桉檸蒎腸溶軟膠囊可顯著減少ALI模型小鼠BALF上清液中總蛋白濃度。同時，本研究病理結果顯示，模型對照組小鼠肺泡間隔增寬，肺泡壁破壞，肺間質水腫，部分肺泡融合，腔內可見滲出、水腫及出血，肺間質炎癥細胞浸潤;而高劑量桉檸蒎腸溶軟膠囊組小鼠肺組織中上述病理變化較模型對照組明顯改善，肺泡壁破壞減少，出血及滲出減輕，這進一步驗證了該藥對模型小鼠ALI的改善作用。

由于目前臨床上對于ALI尚無安全、有效、可靠的治療藥物[11]，故本研究未設置陽性藥物對照組。本研究結果顯示，高劑量蒎腸溶軟膠囊對ALI具有潛在的治療作用，但相關的作用機制以及臨床的實際療效還有待進一步的研究。

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(編輯:林 靜)

Im p rovem ent Effect of Eucalyp tol Enteric Soft Capsu le on Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury in M ice

LIXuan1，YANG Yumei2(1.Dept.of Nephrology，Tianyou Hospital，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430064，China;2.Dept.of Respiratory，Tianyou Hospital，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430064，China)

OBJECTIVE:To investigate the improvement effect of Eucalyptol enteric soft capsule onm ice w ith lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI).METHODS:60 m ice were random ly divided into blank control group，model control group，Eucalyptol enteric soft capsule low-dose，medium-dose，high-dose groups(100，300，900mg/kg)，12 in each group.M ice in administration groups were intragastrically given relevantmedicines，mice in blank control group and model control group were intragastrically given equal volume of normal saline(0.1m L/10 g).A fter 2 h of adm inistration，except for the blank control group，ALIwas induced in other groups by atomized LPS.After 6 h ofmodeling，themice were sacrificed，alveolar lavage fluid(BALF) and lung tissue were taken.Morphological changes of lung tissue were observed under m icroscope;number of total cells，neutrophils in BALF were calculated by blood cell count plate and staining by w right-giemsa respectively.Total protein concentration in BALF supernatant was detected by BCA method;TNF-α，IL-6 contents in BALF supernatant were determ ined by enzyme-linked immunosorbent assay.RESULTS:Compared w ith blank control group，lung tissue of m ice in model control group showed obvious pathological damage and severe pulmonary edema;number of total cells，neutrophils in BALF，total protein concentration and TNF-α，IL-6 contents in BALF supernatantwere significantly increased(P＜0.01).Compared w ith model control group，pathological damage in lung tissue of mice was obviously improved in Eucalyptol enteric soft capsule high-dose group，number of total cells，neutrophils in BALF，total protein concentration and TNF-α，IL-6 contents in BALF supernatantwere significantly decreased (P＜0.05);and there were no significant differences in other groups(P＞0.05).CONCLUSIONS:High-dose Eucalyptol enteric soft capsule can obviously improve LPS-induced ALIofm ice.

Eucalyptol enteric soft capsule;Acute lung injury;Lipopolysaccharide;M ice;Improvement effect

R967

A

1001-0408(2017)19-2655-04

2016-11-15

2017-04-27)

＊主管護師。研究方向:慢性阻塞性疾病、支氣管哮喘。電話: 027-51228500。E-mail:1044500949@qq.com

#通信作者:副主任醫師，副教授，碩士。研究方向:呼吸系統疾病。電話:027-51228500。E-mail:2873174957@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.18